在类器官培养过程中，传代是维持其长期稳定扩增与功能活性的核心环节，而传代效率的高低直接取决于关键步骤的精准把控。以下将从操作手法标准化、类器官自身因素影响、营养体系优化三大维度，详细拆解类器官传代的关键技术要点，为科研人员提供可落地的实践指南。

一、操作手法标准化：以 “流程优化 - 参数量化 - 问题解决” 为核心

类器官传代的操作手法标准化是降低批次差异、提升可重复性的关键，需围绕基质胶冷化、离心条件、消化控制、吹打技巧及分层问题处理五大环节，建立精准的参数体系与动态决策方案。

1. 基质胶冷化：按敏感性匹配温度 - 时长组合

基质胶的冷化处理需根据类器官对温度和时长的敏感性差异调整策略，避免因冷化不当影响后续分离效率与细胞活性：

• 温度敏感型类器官（如部分神经类器官）：推荐 4℃或 0℃预冷 30 分钟，既能保证基质胶充分软化，又可避免低温对细胞的损伤；

• 时长敏感型类器官（如快速增殖的肿瘤类器官）：建议 - 20℃预冷 5 分钟，缩短操作周期以减少细胞暴露在不适环境中的时间。

实验表明，0℃预冷可作为 4℃的替代方案，在维持类器官活性的同时，兼容部分对低温耐受性略高的类型。需特别注意，冷化过程中温度波动需控制在 ±1℃范围内，否则会影响基质胶的黏度一致性，进而干扰后续传代操作。

2. 离心条件：低温与水平角离心协同提升效果

离心环节的核心目标是实现基质胶与类器官的彻底分层，同时最大程度保留细胞活性，关键参数与设备选择如下：

• 核心参数：4℃低温环境、200-300g 转速、5 分钟以内离心时长；

• 离心机选择：优先使用水平角离心机，其在离心过程中可使样本液柱与离心管保持平行，让基质胶与类器官沉淀分层更彻底，相比固定角离心机，基质胶残留率可降低 25%，显著减少后续消化步骤的干扰；

• 类型适配调整：体积较大的类器官（如肝类器官）建议采用 300g 离心 5 分钟，而鼠源类器官可适当降低至 200g，避免因离心力过大造成机械损伤。

3. 消化控制：室温镜检精准判断终点

消化是解离类器官结构的关键步骤，需通过温度控制与镜检观察，平衡解离效率与细胞活性：

• 操作环境与时长：全程在室温超净台内进行，消化时长严格控制在 2-3 分钟，避免高温（如 37℃）导致细胞凋亡率升高（室温操作可使凋亡率降低 15%），尤其适用于胃肠道、食管等对酶解敏感的类器官；

• 终点判断标准：通过显微镜观察细胞团直径，当细胞团达到 50-100μm 时，立即终止消化；

• 酶试剂选择：需匹配类器官组织类型，例如肝类器官推荐使用 TrypLE™ Express 酶室温孵育 5-10 分钟，肠类器官则优先采用 Dispase 或专用消化液 D，防止因过度酶解导致单细胞化，进而降低细胞活性。

4. 吹打技巧：低剪切力实现高效分散

吹打操作的核心是在分散细胞团的同时，减少机械剪切力对细胞的损伤，具体技巧如下：

• 工具选择：采用 1mL 枪头或无菌巴氏吸管，避免使用 200μL 枪头（后者易导致 12% 的细胞碎裂率，而 1mL 枪头可将碎裂率控制在 5% 以下）；

• 操作手法：以轻柔的圆周运动吹打，吹打次数控制在 30 次以内，全程避免产生气泡（气泡会破坏细胞结构）；

• 类型适配调整：囊性类器官建议使用火焰抛光的玻璃巴氏吸管进行机械剪切，密集型类器官可结合 TrypLE Express 酶解后再行吹打，实现 “酶解 + 机械分散” 的协同优化。

5. 问题解决：离心分层的动态决策

离心后常见分层结构为 “缓冲液（上层）- 基质胶（中层）- 类器官沉淀（下层）”，需根据类器官数量动态调整保留策略，避免因处理不当导致细胞损失：

• 数量极少情况（如原代培养或低代数传代）：保留沉淀层 + 基质胶下 2/3，点胶时新胶量需为残留胶的 1.5 倍以上，弥补细胞数量不足的问题；

• 数量中等情况：保留沉淀层 + 基质胶全层，同时增加离心转速至 300g，减少基质胶对后续培养的干扰；

• 分层模糊情况：加入 1mL 预冷缓冲液 G 重悬后，4℃静置 10 分钟，利用密度差异实现二次分离，提升分层清晰度。

操作要点速览

通过上述标准化操作，可使类器官传代效率提升 30%，批次间变异系数从 22% 降至 8%，为长期培养与药物筛选提供稳定技术支撑。

二、类器官自身因素影响：从活性、数量、结构把控传代基础

类器官自身的生物学特性是决定传代效率的内在因素，需从活性强度、数量阈值、结构完整性三个维度进行评估与调控，确保传代过程的可持续性。

1. 活性强度：传代能力的核心决定因素

不同类型类器官的活性强度差异显著，直接影响其传代潜力，可根据传代难度分为 “易传代” 与 “难传代” 两类：

• 易传代类器官：以肠癌、子宫内膜癌类器官为代表，其干性维持能力强，连续传代可达 30 代以上；鼻类器官更具特殊性，可通过自发支持病毒复制实现无需外源性因子的连续传代；

• 难传代类器官：包括肝癌、前列腺癌、甲状腺癌类器官，传代后常因干性耗竭出现生长停滞甚至凋亡；气道类器官则需抑制干扰素通路（如使用 CYT387），才能克服免疫反应导致的传代障碍。

类器官的活性强度与干细胞微环境信号密切相关，例如脑肿瘤干细胞类器官需持续补充 Wnt3a 与 RSPO1 信号分子，若缺失此类干性维持因子，传代后细胞会迅速分化并丧失增殖活性。

2. 数量阈值：密度依赖性增殖的临界调控

类器官传代需满足 “数量阈值”，即单位培养空间内达到足够数量的功能性细胞团，以保障旁分泌信号网络的完整性，避免陷入 “增殖停滞陷阱”：

• 临界数量标准：24 孔板培养体系中，每孔类器官数量需≥20 个；若低于此阈值（如每孔仅 5-15 个），细胞团分泌的生长因子（如 EGF、FGF）浓度不足，会导致增殖效率大幅下降；

• 密度适配调整：铺板密度需严格控制，过高（>150 个 / 孔）会导致营养竞争加剧，培养基 24 小时内即变黄，代谢废物积累抑制生长；过低（<20 个 / 孔）则因自分泌因子匮乏，类器官形成效率降低 50% 以上；

• 收获时机影响：原代类器官的收获时机直接影响数量达标率，例如中 / 后肠球状体需在分化第 5-9 天收集，过早（第 5 天）或过晚（>9 天）均会导致细胞团活性下降，间接减少有效传代数量。

3. 结构完整性：形态学评估与传代时机判断

类器官的结构特征是判断传代时机的直观指标，需通过形态学观察与定量测量联合判断，确保传代时细胞处于最佳生长状态：

• 理想结构标准：

◦ 形态：呈规则囊状（如肠道类器官）、多小叶状（如肝类器官）或分支管状（如肺类器官），无中心暗区及坏死灶；

◦ 直径：人源类器官通常为 200-500μm，鼠源类器官较小（100-200μm），超过此范围易出现中心坏死；

◦ 生长状态：每日直径增幅 5-10%，培养基清澈（未变黄），无局部细胞死亡迹象；

• 传代时机触发：当观察到类器官生长速率减慢（直径每日增幅 < 5%）、培养基 pH 下降（颜色变黄）或局部出现暗腔时，需立即启动传代；

• 碎片大小要求：机械破碎后，需保留 > 100μm 的细胞团碎片，此类碎片的生长率显著高于单细胞或小碎片（<50μm），后者的类器官形成率仅 10-15%；

• 类型适配调整：不同类器官的结构判断标准存在差异，例如食管类器官以 “角化珠形成” 为传代标志（培养 9-14 天），脑类器官则需结合神经球紧凑度及神经元标志物（如 β-III tubulin）表达综合判断。

三、营养体系优化：为传代提供精准 “能量供给”

类器官传代效率的稳定性高度依赖营养体系的精准调控，需从培养基管理、消化液适配、添加剂优化三个维度构建协同体系，平衡干细胞干性维持与定向分化需求。

1. 培养基管理：储存策略与配方适配

培养基是类器官传代的 “能量核心”，其质量控制需关注因子活性维持与个性化配方选择：

• 储存策略：

◦ 完全培养基（含生长因子）需 - 20℃分装储存，有效期可延长至 1 年；

◦ 4℃短期储存需严格控制在 2 周内，超过 1 个月会导致关键因子（如 Wnt3a、R-spondin-1）活性显著下降，使类器官增殖率从 90% 降至 55%；

◦ 传代后干细胞对培养基质量更敏感，需绝对避免使用储存过久的培养基；

• 配方适配：

◦ 肠道类器官：人源推荐使用 IntestiCult™ Organoid Growth Medium (human)，鼠源使用对应小鼠版本，此类培养基通过预优化 Wnt/R-spondin 信号轴浓度，可提升传代后 24 小时贴壁率；

◦ 乳腺类器官：可测试 1 型和 2 型扩增培养基，或采用自制条件培养基（含 R-spondin-1、Noggin 和 Wnt3a）；

◦ 脑肿瘤干细胞类器官：需使用 10-DPM 培养基，其中 4-DPM（RG108、A83-01、毛喉素、Bay K8644）为必需小分子，添加 RSPO1 的 5-DPM 配方可实现长期传代；

• 操作规范：

◦ 商品化培养基（如 IntestiCult™）37℃水浴解冻后应立即使用，禁止再次冷冻；

◦ 基质胶使用浓度需 > 70%，操作全程在冰上进行以防提前凝固；

◦ 换液频率建议每 3-5 天一次，维持稳定的营养微环境。

2. 消化液适配：酶组合与活性维持

消化液的选择与管理直接影响类器官解离效率与细胞存活率，需根据组织类型匹配酶组合，并严格控制酶活性：

• 酶组合选择：

◦ 肠道类器官：推荐使用 TrypLE™ Express，其温和的蛋白水解活性可减少干细胞损伤；

◦ 胰腺类器官：需 Dispase 与 DNAse I 联用，Dispase 分解细胞外基质的同时，DNAse I 可降解游离 DNA，防止细胞团聚；

◦ 专用消化液优势：针对性酶组合可使传代后细胞存活率提升 20%，优于通用消化液；

• 储存与使用：

◦ 消化液需 - 20℃分装保存以维持酶活，有效期可达 1 年；

◦ 4℃储存建议 2 周内用完，超过 1 个月会出现酶活性下降，增加过度消化风险；

◦ 肠道隐窝来源类器官消化后接种时，需添加抗生素（如庆大霉素终浓度 50µg/ml）抑制共生微生物污染，抗生素应在使用前新鲜添加。

3. 添加剂优化：难养类器官的存活调控

针对肝、食管等难养类器官，需通过精准添加信号通路调节剂与生长因子，提升传代效率与细胞存活：

• 难养类器官适配添加剂：

◦ 肝类器官：推荐添加 Oncostatin M（OSM，50ng/mL），通过激活 STAT3 通路促进肝细胞成熟与存活；或使用 Y-27632（10μM）抑制 ROCK 激酶活性，减少传代过程中的凋亡；

◦ 食管类器官：Y-27632 需在接种第 0 天添加，肝类器官可在整个扩增阶段持续使用；

• 扩张培养基因子组合：

◦ 核心成分：包含 EGF、HGF、FGF-10 等生长因子，TGFβ 抑制剂（A83-01、Noggin）及 PKA 激活剂（forskolin），兼顾增殖与干性维持；

• 阶段性调整：

◦ 传代起始阶段：采用低 FGF2 的起始培养基；

◦ 第 4 天：换用含 GlutaMaxx 和 FBS 的 IPS 培养基；

◦ 第 6 天起：切换为 N2 神经诱导培养基，通过阶段性营养调控实现定向分化；

• 试剂盒优势：部分专用试剂盒济研通过优化因子配比，可提升营养体系稳定性，降低批次间差异。