在分子生物学实验中,qPCR(实时荧光定量 PCR)技术以其高灵敏度、高特异性和快速性等优点,被广泛应用于基因表达分析、病原体检测等领域。然而,在实际操作过程中,实验人员常常会遇到各种问题,影响实验结果的准确性和可靠性。本文将根据常见问题及解决办法,为大家详细介绍 qPCR 实验中的注意事项。
一、扩增曲线不光滑
扩增曲线不光滑可能是由于荧光信号太弱,经系统校正后产生。解决方法是确保 Mix 中预留的染料未降解;更换荧光信号收集更好的 qPCR 专用耗材。在实验过程中,应选择质量可靠的试剂和耗材,以保证荧光信号的稳定性和准确性。
Taq SYBR® Green qPCR Premix 是SYBR® Green I嵌合染料法专用qPCR试剂,为2×预混液,包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分,可减少操作步骤,缩短加样时间,降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶,配合精心优化的Buffer体系以及PCR反应促进因子,使产品具有特异性强、扩增效率高等特点,有效抑制非特异性扩增,可对宽广浓度范围的模板进行准确定量,获得稳定可靠的qPCR结果。
预混液中含有独特校正染料,与一系列 qPCR 设备兼容,包括需要 ROX 校正的仪器,实验操作过程中不需要额外添加染料来校正仪器。
二、扩增曲线断裂或下滑
当模板浓度较高,基线的终点值大于 Cq 值时,会出现扩增曲线断裂或下滑的情况。此时,可以减小基线终点(Cq 值 - 4),重新分析数据。在实验前,应合理估计模板浓度,避免过高浓度的模板对实验结果产生不良影响。
三、个别孔扩增曲线突然骤降
如果反应管内留有气泡,会导致个别孔扩增曲线突然骤降。为避免这种情况,应确保 Mix 完全溶解,请勿涡旋振荡混匀;加样完成后轻弹离心去除气泡;延长预变性时间至 10 分钟,以去除气泡。在加样过程中,要细心操作,尽量避免产生气泡。
四、反应结束无扩增曲线出现
反应循环数偏少可能导致反应结束无扩增曲线出现。可以设置循环数为 40,但更多的循环数会增加过多的背景信号。在设置实验参数时,应根据实际情况合理选择循环数,以确保实验结果的可靠性。
五、荧光信号采集步骤未设置或者设置错误
两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火&延伸阶段,三步法扩增程序应当将信号采集设置在 72°C 延伸阶段。在实验前,要仔细检查荧光信号采集步骤的设置,确保设置正确。
六、引物可能降解
长期未用的引物可能会降解,应先通过 AGE 电泳检测完整性,以排除这种可能。对于长期未用的引物,在使用前应进行质量检测,确保引物的完整性和有效性。
七、模板浓度过低
当模板浓度过低时,可以减少模板稀释倍数重复实验,在样品浓度未知的情况下从最高浓度做起。此外,还可以尝试其他方法,如提高引物浓度、优化 PCR 反应程序等,以提高实验的灵敏度。
八、Cq 值出现过早
扩增效率低可能导致 Cq 值出现过早。解决方法包括提高引物浓度、尝试三步法扩增程序或者重新设计引物。在实验过程中,要不断优化实验条件,提高扩增效率。
九、模板降解
如果模板降解,应重新制备模板,重复实验。在实验过程中,要注意保存模板,避免模板降解。
十、扩增产物过长
扩增产物长度应控制在 80 - 200bp。过长的扩增产物可能会影响实验结果的准确性。在设计引物时,要合理控制扩增产物的长度。
十一、体系中存在 PCR 抑制剂
一般为模板带入 PCR 抑制剂,可加大模板稀释倍数或重新制备高浓度的模板重复实验。在实验前,应对模板进行处理,去除可能存在的 PCR 抑制剂。
十二、空白对照出现信号
空白对照出现信号可能是由于反应体系污染。首先更换空白对照的水,如果还发生同样情况,继续更换引物、吸头、PCR 管或启用新的 Mix。反应体系应在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。在实验过程中,要严格遵守无菌操作规范,避免反应体系污染。
十三、出现引物二聚体等非特异性扩增
一般在 35 循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况,应配合熔解曲线进行分析。重新设计引物,调整引物浓度,优化 PCR 反应程序,可以减少非特异性扩增。在设计引物时,要遵循引物设计原则,避免出现引物二聚体等非特异性扩增。
十四、熔解曲线出现多峰
熔解曲线出现多峰可能是引物设计不佳。根据引物设计原则重新设计新引物,可以改善熔解曲线的形状。在设计引物时,要充分考虑引物的特异性和熔解曲线的形状。
十五、引物浓度过高
适当降低引物浓度可以解决引物浓度过高的问题。在实验过程中,要合理控制引物浓度,避免过高或过低的引物浓度对实验结果产生不良影响。
十六、cDNA 模板存在基因组污染
提取后的 RNA 溶液使用 DNA 酶进行消化,例如:dsDNase,以去除基因组污染,或设计跨内含子引物。在实验过程中,要注意去除 cDNA 模板中的基因组污染,以确保实验结果的准确性。
十七、实验重复性差
加样误差大可能导致实验重复性差。使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液;高倍稀释模板,加入大体积模板减少加样误差;放大 qPCR 反应体积等方法可以提高实验的重复性。在实验过程中,要严格控制加样误差,提高实验的重复性。
十八、qPCR 仅不同位置的温度偏差
定期校准 qPCR 仪可以解决 qPCR 仅不同位置的温度偏差问题。在实验过程中,要定期对 qPCR 仪进行校准,确保仪器的准确性和稳定性。
总之,在进行 qPCR 实验时,实验人员应熟悉常见问题及解决方法,严格遵守实验操作规程,选择质量可靠的试剂和耗材,以确保实验结果的准确性和可靠性。
Longen Q2000B荧光定量QPCR 仪具有多类型、多孔、多模块等多重选择,型号从普通的PCR仪到荧光定量PCR仪,从快速PCR仪到梯度PCR仪,种类丰富,规格齐全,已满足不同客户群体的需求。PCR仪采用进口半导体技术以及 MARLOW 半导体芯片制造商生产的半导体材料做为核心部件,确保产品的扩增速度、分析结果及系统可靠性.
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