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单细胞测序技术在遗传学和蛋白质组学的应用
来源: 苏州阿尔法 时间:2022-04-19

单细胞测序技术在遗传学和蛋白质组学的应用

单细胞测序技术在通量、成本和功效方面的持续进步使得对大量单个细胞的分析变得可行。现在可以针对单个细胞分析生物学中心法则的所有关键分子,包括 DNARNA(在细胞和细胞核中)和蛋白质组学。

单细胞遗传信息分析涉及三个关键步骤:分离或分类、裂解和分析。排序过程可以使用单细胞测序技术进行。方法的选择取决于研究领域和主题。单细胞测序的排序方法都依赖于已经解离的细胞;然而,激光显微切割和玻璃毛细管等方法也可以从指定的组织区域收获细胞。激光显微切割具有作为显微镜技术的优势,并且允许在分离之前进行视觉细胞选择。该技术在细胞来源方面也是通用的,适用于细胞悬浮液和组织样本。由热稳定聚合物组成的转移膜与细胞源接触放置。用显微镜识别靶细胞,激光通过紧邻的短脉冲切割细胞,激活转移膜,导致粘着斑形成。细胞粘附后,可以去除薄膜并完成额外的处理。

技术

优点

缺点

逆转录定量PCR

大量人群的遗传特征

非原生细胞环境(悬浮液)

RNA鱼

活细胞选项
空间和时间信息

信号放大可能成本高昂

TIVA

不需要细胞悬液;可以在组织样本上完成

RNA的失位置

3。基因组筛选方法分析。

细胞分离后,必须获得感兴趣的分子以进行进一步的下游处理,例如扩增。对于使用微流体方法获得的细胞,化学裂解是常见的方法。裂解试剂选择重要原则是确保它不会干扰目标分子或对放大和分析阶段的酶或缓冲液产生负面影响。对于裂解液的选择还有一个因素也要考虑,那就是可能需要特殊的仪器来确保在操作过程中不会丢失微量的样品。例如,实验中使用低吸附的移液器吸头进行移液,以避免单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序过程中的 DNA损伤


二代测序文库

单细胞基因表达谱的确定依赖于逆转录酶定量 PCR (RT-qPCR) RNA FISH) 。由于发现三分之二的基因组转录为 RNA,但许多转录本不编码蛋白质。非编码转录物被认为起着关键的调节作用。所以,RNA 的细胞位置对基因表达至关重要 。在一个细胞系的几个细胞区室中进行的研究得出结论,大多数剪接是在转录过程中完成的。考虑到这些因素,单细胞研究主要侧重于 RNA 检测和分析方法,以获得与之相关的信息。

单细胞技术的不足之处在于:它们将细胞从其天然细胞环境中移除。通过消除细胞接触和相互作用,以及丢失所有空间信息,这些技术都可能改变细胞特性甚至丢失有价值的数据参数。随着该领域的成熟,这些问题正在得到解决。比如:体内转录组分析 (TIVA) 能够规避这个问题。TIVA 采用与细胞穿透肽相连的可光活化双链寡核苷酸。该系统被称为“TIVA 标签,它穿过细胞膜,然后失去其肽,从而将其锁定在细胞内。激光照射揭示了在指定细胞中捕获 mRNA 的序列。然后分离和扩增细胞 RNA,以量化整个细胞或特定选择的子隔室的基因表达 。这项技术与完整组织中的神经元细胞相比,分离的神经元细胞的转录本数量相对增加。这也证实了关于细胞间相互作用的相关理论内容

基于液滴的单细胞测序数据的另一个主要问题是细胞双联体的存在。干细胞是单细胞遗传分析的重点领域。识别基因图谱的关键差异对发育生物学和再生医学具有潜在的革命性影响。近期的研究表明具有不同遗传输出的干细胞的异质性。此外,已经实验表明基因表达的差异不会自动预测表型表达的差异。在整个发育过程中正在收集有关细胞命运的信息。

单细胞测序技术在蛋白组学上的应用

蛋白质组学研究也在单细胞水平上进行,以确定细胞的功能差异,并帮助确定扩大遗传探索的关键要素。比如:使用质谱法和纳米孔技术比较容易实现高通量蛋白质组学筛选,其方法为:将细胞分散在载玻片上,细胞核被染色。然后,荧光镜识别每个细胞的位置,并将坐标传递给激光器进行质谱分析。特定基因在单细胞中的表达也可以通过单细胞蛋白质印迹来检测,例如,使用来自 ProteinSimple Milo 单细胞蛋白质印迹来估计表达突触蛋白的肠内分泌细胞(神经足类)的百分比。

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