细胞和CAR-T有望彻底改变医药保健，但这些产品的制造对质量和安全保证策略提出了新的挑战。在支原体检测时尤其如此，支原体是一种无处不在且几乎看不见的细胞培养细菌污染。这些挑战是 2019 年 PharmaLab 支原体 qPCR 检测会前研讨会上演讲的共同主题，特别是考虑到欧洲药典第 2.6.7 章的预期修订。共识点包括，使用细胞基质进行测试的重要性以及将 NAT 定位为快速第一线检测的实施策略的潜力，然后通过基于培养的药典方法进行结果验证。

支原体检测常见问题解答

1. 基于基因、细胞和组织的先进产业药物 (ATMP) 如何给支原体检测带来挑战？ 

生物制药支原体检测的一个关键挑战是周转时间，因为生产延迟可能代价高昂，并且会限制急需药物的供应。这项挑战源于常用的“经典”药典方法，这些方法以文化为基础，需要数周时间才能产生结果。对更快地检测支原体的需求以及监管机构对替代检测方法的接受使核酸扩增技术 (NAT) 成为人们关注的焦点。NAT 可以通过聚合酶链反应 (PCR) 检测支原体 DNA 的存在，从而将获得结果的时间从几周缩短到几小时。

然而，周转时间只是冰山一角。在实施基于 NAT 的方法以确保产品安全时，其他考虑因素也很重要。由于 ATMP 广泛多样， 随着进一步的创新扩大了 ATMP 的方法和应用范围，这种多样性也将随着时间的推移而增加。

2.制造过程中的哪些阶段是合适的测试点？

经验表明，并非生物药物或 ATMP 生产中的所有时间点都适合支原体检测。应根据支原体污染风险最高的点来选择检测点。对于 ATMP，除了用于发布测试的预处理收获之外，还应评估过程中的测试点以包括在内，例如在几代之后测试源材料或初始细胞起始材料。

3.哪些样品类型适合支原体检测？

培养上清液或其他无细胞基质可能不足以进行检测，因为支原体通常会附着甚至侵入细胞。显然，样本选择是经过验证的测试策略的关键参数。此外，需要仔细考虑测试前的样品制备步骤，以确保用于测试的样品类型仍能代表产品。因此，建议避免或完全证明无细胞基质是合理的。事实上，大多数商业测试开发人员都在转向细胞矩阵，并寻找方法来克服由高细胞数引起的技术障碍。

4.您如何构建符合法规要求的简化验证设计？

从验证的角度来看，必须使用复杂的样本 Christiana Schnitzler 曾在演讲中提到过，她正在领导 Boehringer Ingelheim 的一个团队对 Roche CustomBiotech 的 MycoTOOL 支原体实时 PCR 试剂盒进行通用验证。该试剂盒设计用于处理天然样品，Schnitzler 正在检查该检测方法是否对 PCR 抑制剂、DNA 提取变异以及试剂和样品处理具有稳健性。她的目标是证明该检测的灵敏度至少与“经典”药典方法相当。该团队关于检测限的数据仍在收集中，但初步结果表明，十种测试的支原体可以达到法规要求的灵敏度（≤10 CFU/mL）。 

      Schnitzler 的实施方法将测定验证与可比性研究相结合，以确定 PCR 方法是否与“经典”药典培养和指示细胞培养方法一样灵敏、特异和稳健。在这一点上，只有在可以证明这种等效性的情况下，起始基于 NAT 的方法才能替代更费力、样本密集和冗长的金标准方法。罗氏制药多年来一直在其生产车间使用其 MycoTOOL 支原体实时 PCR 解决方案，并利用基于培养的方法进行验证。

5.您如何将基于 NAT 的方法实施到流程工作流中？

  基于 NAT 的商业支原体测试提供了优化的检测架构的便利性，具有广泛的物种覆盖和高灵敏度，以及高通量测试和自动化的选项。

  几位演示者分享了对市场测试的评估和经验教训，这些经验教训可以使其他人更容易实施基于 NAT 的方法。例如，卢布尔雅那大学医学院微生物学和免疫学研究所的 Andrej Steyer 强调需要具有低基因组拷贝与 CFU 比率 (GC:CFU) 且特征明确的验证标准。

  Steyer 比较了 SYBR Green 支原体检测和基于探针的 MycoTOOL 支原体实时 PCR 试剂盒。Steyer 选择专注于基于探针的试剂盒，因为它表现出更好的灵敏度和 CT 值的可变性更小，Steyer 检查了它在两个不同的循环仪和自动 DNA 提取上的性能。研究中使用的两种支原体参考标准之间的 GC:CFU 比率有十倍的差异再次出现在所得的 PCR 和测序数据中。Steyer 建议“牢记支原体参考标准的质量及其可能产生的影响。”

6.欧洲药典第 2.6.7 章的预期修订对使用基于 NAT 的支原体检测方法有何影响？

实施基于 NAT 的支原体检测方法需要全面验证和证明性能至少与“经典”药典方法相当。研讨会上讨论的主题强调了在验证和实施基于 NAT 的方法方面需要更详细的指导。但是，必须确保具体建议不会分散制定与未来产品相关的指南的注意力。 

  现有基于 PCR 的支原体检测的物种覆盖范围相当全面。例如，MycoTOOL 支原体实时 PCR 试剂盒理论上可覆盖大约 150 种可培养和不可培养的菌株。这种广泛的覆盖范围可用于通用验证。其中，维也纳兽医大学微生物学研究所教授 Renate Rosengarten 教授和 Mycosafe Consulting 主任建议扩大使用基于 NAT 的方法进行测试所需的支原体物种清单，以便根据产品相关性进行选择基于风险评估确定的潜在进入后的增长能力。

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