细胞外囊泡简称“EV”,它的分子构成较为复杂，主要包括表面受体、膜和可溶性蛋白质、脂质、基因组 DNA 和异质范围的 RNA，包括 mRNA、microRNA、tRNA、rRNA、小核仁 RNA、小环状核仁 RNA、piRNA、scaRNA、病毒 RNA、Y RNA和长链非编码 RNA等。目前，在细胞外囊泡的分离和表征、细胞外泌体中microRNA图谱等方面已有深入的研究， 其中研究细胞外囊泡EV 的 microRNA 图谱的方法包括 qRT-PCR、高通量测序和 microRNA 微阵列等。

一、细胞外囊泡分离步骤

   根据供应商提供的说明，可使用来自血清或细胞培养基 (ThermoFisher) 的总外泌体分离试剂从 1 至 3 ml 血清或 2 ml 组织培养上清液中通过沉淀从血清或细胞条件培养基中分离出细胞外囊泡。立即处理产生的 EV 颗粒以进行 EV 表征或下游 RNA 分离。然后通过差速超速离心 (UC) 从细胞条件培养基制备 EV . 简而言之，将条件培养基在 4°C 下以 400 × g 离心 5 分钟以排除分离的细胞和碎片，然后在 4°C 下以 2000 × g 离心 20 分钟。将上清液转移至离心管（耐思nest）并以 10,000×g 离心 45 分钟，然后在 Beckman L8-80 超速离心机中离心。EV 颗粒在 60 ml  PBS 中洗涤，在 4°C 下以 100,000 × g 再次离心 90 分钟，然后重新悬浮在 > 100 μl 无菌无颗粒 PBS (Gibco) 中并储存在 -80°C 用于下游EV 表征或 RNA 分离。

二、细胞外囊泡表征

1.透射电镜观察

使用 Pioloform® (SPI Supplies) 拍摄的 300 目网格（Gilder 网格）进行透射电子显微镜 (TEM)，这些网格在使用前经过碳涂层和等离子蚀刻。将每个 EV 颗粒重新悬浮在 100 μl 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中，每个网格拾取 10 μl 液滴，孵育 5 秒并去除多余的样品。网格用醋酸双氧铀 (Agar Scientific) 染色，风干并使用 Hitachi HT7800 透射电子显微镜检查。

2.纳米粒子追踪分析

      使用配备有 NTA 软件 v2.3（NanoSight Ltd）的 NanoSight LM10-HS 显微镜（Malvern Panalytical Ltd）进行纳米粒子跟踪分（NTA）。每个样品记录三个 60 秒的记录，在无菌过滤的 PBS (Sigma) 中以 1:10,000 稀释。使用高分辨率纳米单颗粒分析仪 Nanocoulter Ⅰ进行颗粒粒径、浓度、zeta电位、形态多维度检测。

    (a) EV 标记 CD63、CD81 和 CD9 的阳性染色以及适当的同种型对照，使用从细胞培养上清液中分离的 EV 通过流式细胞术进行评估。 

    (b) 透射电子显微镜显示预期大小范围（30-200 nm）和形态（杯形囊泡）的分离血清 EV。(c) 阳性 EV 标记 Flotillin-1 和 Alix 表达的蛋白质印迹分析。

    (d) 基于 NanoSight 的纳米粒子跟踪分析，表明 EV 尺寸分布在预期范围内（模式 105.4 nm）。

    (e) 使用生物分析仪 (179 pg/ul) 评估从 EV 中分离的 RNA 浓度。

3.流式细胞术

     对于 EV 表面标记 CD64、CD9 和 CD81 的流式细胞术 (FC) 评估，使用转轮在室温下过夜孵育，将 EV 包被到 4 μm 醛/硫酸盐乳胶珠 (ThermoFisher) 上。然后在室温下用 1 M 甘氨酸 (Sigma) 封闭游离反应位点 30 分钟。珠子在 PBS + 0.5% 胎牛血清 (FCS) 溶液 (Invitrogen) 中洗涤 3 次，在 4°C 下与抗人 PE CD63 (H5C6)、PerCPCy5.5 CD9 (M-L13) 孵育 2 小时和 APC CD81 (JS-81) 抗体或相应的同种型对照（全部来自 BD Biosciences），然后最后一次清洗。使用细胞成像分析仪进行数据采集分析。

4.蛋白免疫印迹分析

      Alix 和 Flotillin-1 的蛋白质印迹 (WB) 主要通过使用 2% 十二烷基硫酸钠 (SDS) 和手动剪切（1 毫升注射器和 0.8 × 38 毫米 21G 针头 (Terumo)）裂解 EV 进行。按照制造商的说明，使用 Micro BCA™ 蛋白质测定试剂盒 (ThermoFisher) 确定蛋白质定量。使用波长为 575 nm 的酶标仪来测量吸光度值。蛋白质裂解物在含有 0.2% 溴酚 (Fisher Scientific) 和 50 μl/ml β-巯基乙醇 (Sigma) 的 Laemmli 缓冲液中稀释，并在加载到 4%–20% Mini-PROTEAN® TGX™ Precast 之前加热至 95°C凝胶 (Bio-Rad Laboratories) 以及对照品和分子 Precision Plus Protein™ 双色标准品 (Bio-Rad Laboratories)。通过电印迹实现转移到 PVDF 膜上。用搅拌和封闭缓冲液（PBS + 0.1% Tween 20、5% 脱脂牛奶和 5% BSA）封闭印迹。将印迹与 1:1000 一抗和 5 ml PBS-Tween 20 (PBS-T) 以及 5% 脱脂牛奶和 0.5% BSA 一起孵育。使用 1:1500（多克隆山羊抗小鼠，Daco）和 PBS-T 应用二级抗体。使用透明试剂 (Bio-Rad)、LI-COR Odyssey FC 成像系统和 Image Studio 软件 (LI-COR) 在化学发光检测下使印迹可视化。

5.RNA分离与浓缩

使用总外泌体和蛋白质分离试剂盒 (Invitrogen) 从 EV 中分离出总 RNA。使用 NanoString Technologies 批准的离心方案将 RNA 浓缩至 25 μl，并使用上样体积0.5ML的超滤管（默克密理博）进行离心过滤。使用生物分析仪和 RNA 6000 Pico 试剂盒对采集的 RNA 进行定量分析。

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