1 -戴干净的手套；
2 -用75%酒精清洗移液管和支架；
3 -解冻DNA样本和所有试剂（（2×TaqMan基因表达主混合液（Applied BioSystems）、引物（10 μM）和探针（10 μM）)；
4 -轻轻混合DNA样品，并在涡旋器上充分混合试剂。
5 -用离心机对DNA样品和试剂进行离心； 6 -试剂置于冰上；
7 -标记微管，使其准备好用于混合物的制备。
8 -所需设备：ABI Step One Plus实时PCR系统（Applied BioSystems） 9 -所需耗材：96孔板（100ul）
反应设置
1 -根据表1中的指南，制备所需反应次数的反应混合物。组装除样品外的 所有所需组件，将等量的样品分配到每个反应孔中，并在最后一步向每个反应 管中加入样品。
表1.反应混合物的制备。
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组件 |
每次反应的体积， μ l |
规格 |
|
2×TaqMan基因表达Master Mix |
10 |
1 × |
|
（10 μM）正向引物 |
1.8 |
900nM |
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（10 μM）反向引物 |
1.8 |
900nM |
|
（10 μM）探头 |
0.5 |
250nM |
|
样本DNA |
4 |
|
|
无RNase/DNase的水 |
1.9 |
|
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总量 |
20 |
|
2 -在旋涡中充分混合平板，然后短暂离心。
热循环条件
对于朗基荧光定量 PCR 仪，热循环条件补充如下：
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温度（℃） |
时间 |
循环次数 |
|
50 |
2 min |
1 |
|
95 |
10 min |
1 |
|
95 |
15 sec |
40 |
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60 |
60 sec |
40 |
使用朗基荧光定量 PCR 仪配套的分析软件（具体版本以仪器实际配置为准）分析荧光累积数据。操作时，可先将实验数据导入软件，通过设置基线范围、阈值等参数，软件会自动识别荧光信号的变化趋势，进而完成对目标基因的定量分析（如计算 Ct 值、绘制标准曲线等）。
详细操作可参照朗基荧光定量 PCR 仪的用户手册，以确保参数设置符合实验要求，获得准确的分析结果。
