类器官的构建依赖于具有多向分化潜能的细胞类型，主要来源包括：
| 方法 | 适用对象 | 技术要点 |
|---|---|---|
| 机械解离 | 脆弱组织（如脑组织） | 剪刀精细剪切→梯度离心→100μm滤网过滤 |
| 酶解法 | 致密组织（如肿瘤、肠道） | 胶原酶IV（1-2mg/ml）+分散酶（37℃，20-40min）→DNase I处理抑制细胞聚集 |
| 冷冻组织复苏 | 生物样本库样本 | 37℃水浴快速解冻→梯度稀释去除DMSO→PBS洗涤 |
注：细胞活性需＞85%（台盼蓝染色检测），组织碎片大小控制在0.1-0.5mm³
球状体作为类器官发育的初级结构，其形成方法需根据细胞特性选择：
| 方法 | 原理 | 参数控制 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| 低吸附板培养 | 表面改性抑制细胞贴壁 | 细胞密度1×10⁴-5×10⁴ cells/ml | iPSCs/ESCs类器官 |
| 悬滴培养 | 重力驱动细胞聚集 | 液滴体积20-30μl，细胞密度5×10³ cells/drop | 均质球状体制备 |
| 旋转生物反应器 | 动力学微环境促进均匀生长 | 转速25-50rpm，剪切力＜0.5Pa | 大规模生产（如肝类器官） |
| 微流控芯片 | 精确控制微环境参数 | 通道宽度100-200μm，流速0.1-10μl/min | 高通量筛选 |
培养基组成：基础培养基（DMEM/F12）+ B27（1:50）+ N2（1:100）+ 双抗（青霉素-链霉素）+ 特异性生长因子（如Wnt3a 50ng/ml）
球状体需包埋于细胞外基质（ECM）模拟物中，以提供结构支撑和生化信号：
| 基质类型 | 主要成分 | 浓度 | 固化条件 | 优缺点 |
|---|---|---|---|---|
| Matrigel® | 层粘连蛋白（60%）、胶原蛋白IV（30%） | 8-12mg/ml | 37℃，5-15min | 生物学活性高，批次差异大 |
| 胶原蛋白I凝胶 | 牛/鼠源胶原蛋白I | 2-3mg/ml | 37℃+0.1M NaOH | 机械强度可调，成本较低 |
| 合成肽水凝胶 | RGD序列修饰的PEG | 5-10% w/v | 光交联（365nm） | 成分明确，可定制化 |
| 脱细胞ECM | 组织来源脱细胞基质 | 3-5mg/ml | 温度敏感型固化 | 保留天然ECM拓扑结构 |
操作规范：基质与球状体悬液按1:1混合，快速接种于预冷培养板，避免提前固化
通过时序性添加生长因子组合，引导球状体向目标器官分化：
培养周期管理：
| 评估维度 | 检测方法 | 合格标准 |
|---|---|---|
| 形态结构 | H&E染色、免疫荧光 | 呈现器官特异性微结构（如肠绒毛、脑皮质层） |
| 细胞组成 | 流式细胞术、单细胞测序 | 含目标器官主要细胞类型（＞80%） |
| 功能成熟度 | 电生理（脑类器官）、白蛋白分泌（肝类器官） | 功能指标达体内水平的30-50% |
| 遗传稳定性 | 核型分析、全基因组测序 | 无显著染色体畸变 |
类器官技术通过整合干细胞生物学、材料科学与生物工程学，实现了体外器官发育的高度模拟。随着血管化、免疫化及标准化技术的突破，类器官将在疾病建模、药物筛选、再生医学等领域发挥不可替代的作用。未来研究需聚焦于提升类器官生理相关性，推动其从基础研究向医学转化迈进，最终实现精准医学的个体化解决方案。
参考文献
[1] Clevers H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 2016
[2] Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014
[3] Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009
