ELISpot技术是近年来发展起来的一种新的免疫学检测方法，它是ELISA技术的延 伸。目前该方法主要用于检测分泌 IFN-y 的细胞毒性T 细胞及其频率，初步筛选 CTL 识别的抗原肽表位。也可检测免疫细胞在单个细胞水平上分泌其他细胞因子的频率。
该方法将识别细胞因子的抗体包被于特制酶标板的PVDF 膜或硝酸纤维素膜上，加 入待检活细胞孵育，细胞所分泌的相应细胞因子立即与膜上包被的抗体特异性结合，洗 涤去除细胞后，依次加入酶标二抗及沉淀性显色底物，即可在分泌相应细胞因子的细胞 所处局部的膜表面显现有色斑点。一个斑点表示一个分泌某种细胞因子的细胞，通过计 数，可以推算出这种细胞的频率。
1. 包被：用pH 7.2 、0.15M PBS稀 释IFN-y 特异性单抗，使其终浓度达到5~10μg/ml, 加入 Millipore 的 PVDF 膜 板中，100μl/ 孔，4℃ 放置过夜。
2. 封闭：弃包被上清，用无 菌 PBS 洗6次，每孔加入200 μl RPMI 1640-10%FCS培养液，室温 下放置2 h。
3. 加细胞孵育：用无菌 PBS 洗板6次，每孔均加入20 μl 含有 肽段或植物血凝素的培养液。分离正常人外周血单个核细胞 (PBMC), 用培养液调整细胞浓度 为2×10⁵~1×10⁶/ml, 每孔加入 180μl, 放37℃,5% CO₂ 孵箱培 养6～24 h。
4. 加 生 物 素 化 二 抗 ： 用 0.05%Tween20-PBS 洗板6次，每 孔加入100 μl 生物素化IFN-y 特 异性单抗，室温放置2～4h。
5. 加亲和素-酶复合物：用 0.05%Tween20-PBS洗板6次，每 孔加入100 μl 亲和素标记的碱性 磷酸酶，室温放置1～2h。
Tween20-PBS洗板6次，每孔加入100μl BCIP/NBT底物液，室温避光静置10 min 至 1h。
7.计数：肉眼或解剖显微镜下计斑点数(见图14-3)。
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细胞数量必须适中，太多会造成斑点过密甚至融合，无法计数；太少则不能显 现可见斑点。 一般细胞数量控制在5×10⁴~2×10⁵/孔之间，具体数量视实验中刺激剂 强度及细胞类型而定，需预实验摸索。如采用PHA 刺激PBMC 检测IFN-y 时，细胞数 甚至可降低至1×10⁴/孔。
2. 加入细胞后，需小心将酶标板平放入孵箱中静置，孵育期间不要移动酶标板， 以免分泌细胞因子的细胞移动，造成斑点模糊甚至重叠。
4. 显色过程必须避光。每步洗涤要充分，否则背景会增高。
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