一、实验材料 水稻叶片或小鼠肝组织。
二、实验室仪器： 研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、实验试剂
1 、无 RNA 酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（ 180 ℃ 2 小时）装蒸馏水，然后加入 0.01%
的 DEPC （体积
/体积），处理过夜后高压灭菌。
2 、75% 乙醇：用 DEPC 处理水配制 75% 乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻 璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、 1 ×层析柱加样缓冲液； 20mmol/L Tris · Cl(pH7.6) ， 0.5mol/L NaCl ， 1mmol/L EDTA(pH8.0) ， 0.1% SDS 。
4、洗脱缓冲液： 10mmol/L Tris · Cl (pH7.6) ， 0.05% SDS 。
四、动植物总 RNA 提取操作步骤
（一）动植物总 RNA 提取 -Trizol 法 Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用 Trizol 法提取的总 RNA 绝无蛋白和 DNA 污染。 RNA 可直接用于 Northern 斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液 N 中磨成粉末后，再以 50-100mg 组织加入 1ml Trizol 液研磨，注意样品总体积 不能超过所用 Trizol 体积的 10%。
2、研磨液室温放置 5 分钟，然后以每 1mlTrizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用 手剧烈摇荡离心管 15 秒。
3 、取上层水相于一新的离心管，按每 mlTrizol 液加 0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置 10 分钟， 12000g 离心 10 分钟。
4、弃去上清液，按每 ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75% 乙醇，涡旋混匀， 4 ℃下 7500g 离心 5 分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥 5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低 RNA 的 溶解度。然后将 RNA 溶于水中，必要时可 55 ℃-60 ℃水溶 10 分钟。 RNA 可进行 mRNA 分离，或贮 存于 70%乙醇并保存于-70℃。
[注意 ]
1、整个操作要戴口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在 -70 ℃保存一个月以上， RNA 沉淀在 70% 乙醇中可在 4 ℃保存一周， -20 ℃保存一年。
（二） mRNA 提取 由于 mRNA 末端含有多 poly(A)+ ，当总 RNA 流径 oligo(dT) 纤维素时，在高盐缓冲液作用下， mRNA 被特异的吸附在 oligo(dT) 纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA 可被洗下，经过两次 oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的 mRNA 。
1、用 0.1mol/L NaOH 悬浮 0.5-1.0g oligo(dT) 纤维素。
2 、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经 DEPC 处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯 德吸管中，柱床体积为 0.5-1.0ml，用 3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用 1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的 pH 值小于 8.0 。
4 、将（一）中提取的 RNA 液于 65 ℃温育 5 分钟后迅速冷却至室温，加入等体积 2x 柱层析缓冲 液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有 RNA 溶液进入柱床后，加入 1 倍柱床体积的 1x 层析 柱加样溶液。
5 、测定每一管的 OD260 ，当洗出液中 OD 为 0 时，加入 2-3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以 1/3 至 1/2 柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定 OD260 ，合并含有 RNA 的洗脱组分。
7、加入 1/10 体积的 3M NaAc(pH5.2) ， 2.5 倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20 ℃ 30 分钟。
8、 4 ℃下 12000g 离心 15 分钟，小心弃去上清液，用 70% 乙醇洗 涤沉淀， 4 ℃下 12000g 离心 5 分钟。
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥 10 分钟，或真空干燥 10 分钟。
10、用少量水溶解 RNA 液，即可用于 cDNA 合成（或保存在 70% 乙醇中并贮存于 -70 ℃）。
当然，如果使用天根或碧云天的动植物组织 mRNA 提取试剂盒也会省去很多步骤，节约实验耗材成本。
[注意 ]
1、 mRNA 在 70% 乙醇中 -70 ℃可保存一年以上。
2、 oligo(dT) 纤维素柱用后可用 0.3mol/l NaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入 0.02% 叠氮钠（NaN3) 冰箱保存，重复使用。每次用前需用 NaOH 水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
