苏州阿尔法生物实验器材有限公司

常见问答
亲和层析法分离和纯化蛋白技术
来源: 阿尔法生物 时间:2022-05-16

标签:抗体 亲和层析 蛋白质结构 蛋白质纯化 标签抗体 蛋白质特异性 缓冲液

    亲和色谱依赖于蛋白质与基质结合配体的特异性和可逆结合。配体可以直接与感兴趣的蛋白质结合,例如,用于结合 cAMP 的 PKA RIα 和 RIIβ 蛋白质的 cAMP 树脂,或与蛋白质共价连接的标签。亲和层析是常用的蛋白质纯化程序,通常用于纯化方案的初始阶段。根据下游应用,亲和纯化是获得足够纯度重要方法。

 蛋白质

上图.蛋白质上的净电荷受其溶剂 pH 值的影响。在 pH=pI 时,蛋白质的净电荷为零,因此不会与阳离子交换或阴离子交换固定相结合。将 pH 值调整为高于或低于蛋白质的 pI 将导致净电荷,并且蛋白质与阴离子交换 (pH > pI) 或阳离子交换 (pH < pI) 固定相结合。

   用于亲和层析的固定相由共价连接到配体的惰性基质制成,该配体与蛋白质或蛋白质组特异性结合。惰性基质通常由交联的琼脂糖或聚丙烯酰胺组成。可以通过亲和层析以选择性或非选择性方式纯化蛋白质。在选择性亲和层析中,使用对蛋白质特异的配体或共价连接的标签。在非选择性亲和层析中,例如用于免疫球蛋白的蛋白 A、G、L,或用于 DNA 结合蛋白的肝素,或用于糖蛋白的凝集素,配体与具有相似结合能力的一组蛋白质结合。例如,通过扁豆凝集素亲和柱层析纯化表达以生产 SARS-CoV-2 S 包膜蛋白 。

在这两种类型的亲和层析中,蛋白质在影响蛋白质(或标签)与其配体之间结合的条件下被加载到柱子上。在不破坏特定相互作用但会破坏污染蛋白质和固定相之间的任何非特异性相互作用的条件下洗涤结合的蛋白质。然后用含有竞争分子或破坏所有蛋白质/蛋白质相互作用的条件的缓冲液洗脱结合的蛋白质。竞争分子与配体结合,取代感兴趣的蛋白质。这种竞争分子通常通过另一个色谱程序或透析从感兴趣的蛋白质中去除。通过破坏所有蛋白质/蛋白质相互作用从固定相洗脱蛋白质的方法包括调整缓冲液的 pH 值或离子强度。这些方法会影响蛋白质的稳定性,建议立即中和或稀释洗脱的蛋白质,以尽量减少蛋白质损伤。

蛋白质纯化

配体

洗脱

抗体(抗原特异性)

抗原肽

游离肽

多组氨酸标签蛋白

Ni 2+ Co 2+

咪唑或游离组氨酸

标记蛋白

FLAG 特异性抗体

FLAG肽或低pH

GST标签蛋白

还原型谷胱甘肽

离谷胱甘肽

Myc标签蛋白

Myc 特异性抗体

pH

抗体(特定类别)

蛋白质 A、G 或 L 或鱼精蛋白

极端的 pH 值

DNA结合蛋白

肝素

高离子强度

表 1。具有用于特异性和典型洗脱条件的官能团(配体)的选择性和非选择性亲和色谱的示例。

   在设计用于蛋白质表达的质粒时,可以将亲和标签插入到 N 端或 C 端(或在少数情况下,插入具有已知结构的蛋白质的柔性环中)以帮助纯化。抗体通常基于抗体与其抗原(抗体识别的序列)之间发生的高度特异性相互作用进行纯化。可以将含有抗原的肽与基质偶联以特异性结合抗体。降低洗脱缓冲液的 pH 值会破坏抗体/肽相互作用以释放结合的抗体。这种方法通常在商业上用于从粗血清中分离抗体。

离子交换色谱

 2.离子交换色谱。蛋白质以低离子强度与带电固定相结合。可通过增加缓冲液的离子强度或通过调节 pH 值来洗脱结合的蛋白质。

蛋白质也可以以非选择性方式进行亲和纯化。在非选择性纯化中,附着在固定相上的配体与具有相似结合配偶体的一组蛋白质结合。

非选择性亲和纯化,比如: DNA 结合蛋白的纯化。肝素在结构和电荷上都模拟 DNA,可用作亲和纯化 DNA 结合蛋白的配体。虽然理论上所有的 DNA 结合蛋白都可以与这个固定相结合,但大多数其他蛋白质会在没有结合的情况下流过,从而导致感兴趣的蛋白质充分富集。另一个例子是通过将抗体的恒定 (Fc) 区与配体、蛋白 AG L 结合来富集抗体。对于 IgM,可以使用鱼精蛋白亲和层析。

使用类似的结合模式(抗体与蛋白 AG L 配体结合),抗体的抗原结合 (Fab) 区域仍可用于与其特异性抗原结合。因此,可以基于偶联的配体/抗体和抗体/抗原之间的特异性相互作用来纯化特定的蛋白质。

常见问题和故障排除

问题

原因

解决方案

蛋白质不结合

标签未翻译或不可访

检查质粒序列或将标签移动到不同的位置

约束条件不合适

调整缓冲条件

没有足够的时间进行绑定

降低流速或停止色谱柱以允许孵育

蛋白质不洗脱

配体和标签之间的亲和力非常高

增加竞争对手的集中度(特定)或条件的严格性(非特定)

蛋白质聚集在柱子上

调整缓冲液条件以获得更高的蛋白质稳定性

低分辨率

流速太快或太慢

调整流量

色谱柱未充分清洗

用更严格的缓冲液洗涤;根据制造商清洁固定相

蛋白质聚集在柱子上

调整缓冲液条件以获得更高的蛋白质稳定性

洗脱条件不够严格

提高竞争对手的集中度(特定)或调整条件(非特定)

蛋白质在手术过程中失去活性

蛋白质未折叠或聚集

调整缓冲液条件以获得更高的蛋白质稳定性

在纯化过程中去除了活性所需的辅助因子

添加辅因子

     苏州阿尔法生物提供的 组氨酸标签蛋白亲和纯化介质金属螯合亲和层析法的蛋白纯化实验中,另外提供 GST-tag蛋白亲和纯化介质MBP-tag蛋白亲和纯化介质 生物素 Biotin-tag蛋白亲和纯化介质Strep-tagll标签亲和纯化介质 标签抗体亲和纯化介质离子交换层析介质疏水层析介质 磁性微球 琼脂糖凝胶过滤介 葡聚糖凝胶过滤介质 等蛋白纯化介质填料。0512-62956104或18934597460.