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蛋白质免疫印迹实验中条带过多的原因及解决办法?
来源: 苏州阿尔法生物 时间:2021-12-29

标签:免疫印迹 蛋白质 科普 抗体  蛋白质免疫印迹

    蛋白质免疫印迹是检测复杂混合物中蛋白质抗原的常用技术。通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品,然后将分离的蛋白质转移到膜上。这些膜与特定于目标蛋白质的抗体一起孵育,该抗体与固定在膜上的蛋白质条带结合。然后使用检测系统对抗体进行可视化,该系统通常基于与 Ig 链结合的二级蛋白质,该蛋白质与显色反应相关。

与理论预测相反,检测到几个波段的情况并不少见。虽然抗体可能并不完全针对蛋白质,但其他因素可能是原因:

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1. 抗原的蛋白水解分解。

这种情况并不少见,特别是如果样品储存时间过长,或者在起始组织均质化后分离蛋白质或膜。所有附加条带的表观分子量均低于全长蛋白质。特别易感的是突触蛋白和突触结合蛋白。应考虑添加蛋白酶抑制剂,如 PMSF、胃蛋白酶抑制剂或亮抑酶肽。 

2. 每条泳道蛋白质过多或检测系统过于敏感。

蛋白质免疫印迹法中,凝胶过载是“鬼带”的常见原因之一。固定的蛋白质可以提供一个集中的吸附表面,某些 IgG 可以非特异性地结合到该表面。类似地,当使用高度灵敏的检测系统(例如增强的化学发光)时,可能会发现这种非特异性结合。起始材料的一系列稀释通常会澄清哪些信号是人为的。

3.低效阻塞。

实验中会应用到多种不同的封闭剂,某些非离子去污剂或蛋白质等封闭剂容易产生低效阻塞的影响。如果改变阻塞条件就可以解决此问题。

4. 抗原浓度过低。

SDS-PAGE 的分辨率一般限制在 50-100 个波段。如果抗原的相对浓度过低(小于总蛋白的 0.2%),则可能难以检测(例如,突触释放蛋白/VAMP 与细胞匀浆中的组蛋白共迁移,干扰其检测)。信号增强可能会导致人工带的出现。因此可以适当考虑通过分级分离或免疫沉淀富集抗原。


蛋白质免疫印迹技术中,以上所遇到的问题就是关于多条带产生的常见问题。通过以上几个方面进行分析验证即可排除。 苏州阿尔法生物十三年专注于生命科学领域实验室设备及实验室耗材和试剂供应领域,包括振荡培养箱、生物反应器、移液器、离心机、显微镜等,集实验室设计规划、实验室仪器设备、生物实验器材供应、售后服务为一体,使您的实验室采购更加方便快捷。 0512-62956104 18934597460.