一、载体与质粒的基本定义

1. 载体（Vector）

   指通过重组 DNA 技术，将有用的目的 DNA 片段送入受体细胞进行繁殖和表达的工具，细菌质粒是其中常用类型。
2. 质粒（Plasmid）的基本特征
   • 结构：染色体外的双链、闭环 DNA 分子，大小 1-200kb，以超螺旋状态存在于宿主细胞。
   • 存在范围：主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中。
   • 功能：具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定拷贝数并表达遗传信息。
   • 宿主依赖：复制和转录需依赖宿主细胞的酶和蛋白质，离开宿主无法存活；但宿主无质粒也可正常存活。
   • 天然质粒举例：F 质粒（F 因子 / 性质粒）、R 质粒（抗药性因子）、Col 质粒（产大肠杆菌素因子）。

二、质粒的关键特性

1. 质粒的复制类型

2. 质粒的不相容性（Incompatibility）

• 同一复制系统的不同质粒：无法在同一宿主细胞共存，因复制和分配时竞争，几代后少数质粒会丢失，仅存一种。
• 不同复制系统的质粒：可在同一宿主细胞中稳定共存。

3. 质粒的表型特征

• 对抗生素的抗性；
• 产生抗生素、大肠杆菌素、肠毒素；
• 降解复杂有机物；
• 编码限制性内切酶与修饰酶。

三、质粒载体的构建与理想特性

1. 质粒载体的构建（基于天然质粒改造）

• 保留核心功能：人工添加 1 个及以上选择性标记基因（如抗生素抗性基因）、含多个限制性内切酶识别位点的 多克隆位点序列。
• 简化结构：去除大部分非必需序列，减小分子量，便于基因工程操作。
• 辅助序列：携带多用途序列，如肉眼鉴定重组克隆、产生单链 DNA（用于测序）、体外转录外源 DNA、鉴定片段插入方向、外源基因大量表达。

2. 理想克隆载体的特性

1. 分子量小、多拷贝、松弛控制型；
2. 具有多种常用限制性内切酶的单切点；
3. 能插入较大的外源 DNA 片段；
4. 具有易操作的检测表型。

3. 常用质粒载体

大小多为 1-10kb，如 pBR322、pUC 系列、pGEM 系列、pBluescript（pBS）。

四、细菌质粒 DNA 的分离与存在形式

1. 分离的 3 个基本步骤

1. 培养细菌：使质粒扩增；
2. 裂解细胞：用溶菌酶破坏细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）或 Triton X-100 裂解细胞膜；
3. 分离纯化：
   • 染色体 DNA：缠绕于细胞碎片，因分子大易断裂为线性片段，经热 / 酸 / 碱处理后变性，难以复性；
   • 质粒 DNA（共价闭合环状 DNA，cccDNA）：变性后可复性，以超螺旋形式溶于液相。

2. 质粒 DNA 的 3 种存在形式

• 超螺旋 DNA：天然状态，共价闭环，电泳泳动速度最快；
• 开环 DNA（ocDNA）：一条链一处或多处断裂，形成松弛环状；
• 线状 DNA（Linear DNA）：两条链在同一处断裂，电泳泳动速度最慢。