质粒DNA的酶切

一、实验目的：

检测重组质粒是否成功，外源片段是否正确插入到质粒载体中。

二、实验原理：

限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： 第一类（I型）限制性内切酶、第二类（II型）限制性内切酶和第三类（ III型）限制性内切酶。

现在商业化的内切酶一般都是II型限制性内切酶，具有以下三个特点：

1. 识别位点的特异性：每种酶都有其特定的 DNA识别位点，通常是由 4，5，6或 7甚至更多个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。

2. 识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。识别序列有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。

如EcoRI的识别顺序为：

5'…… GAA|TTC ……3'

3'…… CTT|AAG …… 5'

垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG。

3. 切割位点的规范性： 双链 DNA被酶切后，可形成粘性末端或平末端DNA分子。
粘性末端：交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键。

如EcoRI的识别顺序为：

5'…… G'AA|TT_C ……3'

3'…… C_TT|AA'G …… 5'

_和'表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5'G………  5'.AATTC，3'CTTAA.和3'……...G二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。

平头末端：在同一位置上切割双链，产生平头末端。

如EcoRV 的识别位置是： 

5'…… GAT'|ATC …… 3'

3'…… CTA'|TAG …… 5'

'表示在双链上交错切割的位置，切割后形成5'…… GAT   ATC …… 3'和3'……CTA和 TAG……5'二个片段，这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。

三、实验试剂：

1. 质粒DNA

2. 酶切缓冲液（TaKaRa）

3. 限制性内切酶（TaKaRa）

4. ddH₂O

5. TAE电泳缓冲液

6. 琼脂糖

四、实验步骤：

1. 在微量离心管中配置如下酶切体系：

2. 适宜温度反应3小时。

3. 琼脂糖凝胶电泳检测。

五、注意事项:

1. 质粒酶切所用缓冲液参照试剂目录选择。单酶切选用产品附带的缓冲液，双酶切根据试剂目录选择最适缓冲液。

2. 一般1 μg质粒至少加1 U酶，酶切体系中酶的体积不超过1/10。

3. 根据试剂目录选择最适酶切温度。 

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