聚合酶链式反应（PCR）作为一种强大的分子生物学技术，在生命科学研究、医学研究、法医学等众多领域都发挥着至关重要的作用。深入了解 PCR 反应体系与反应条件，对于准确、高效地进行实验 非常重要。

一、标准的 PCR 反应体系

标准的 PCR 反应体系包含多个关键成分。主要有：

10×扩增缓冲液，它为反应提供稳定的化学环境。4 种 dNTP 混合物，即脱氧核糖核苷三磷酸（包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP），各以 200umol/L 的浓度存在于体系中，为 DNA 合成提供原料。引物是 PCR 特异性反应的关键，各 10～100pmol 的引物决定了扩增的起始位置和方向。模板 DNA 的量通常在 0.1～2ug 之间，它是待扩增的目标 DNA 片段。Taq DNA 聚合酶以 2.5u 的量参与反应，催化 DNA 合成。Mg2+浓度为 1.5mmol/L，它对 PCR 反应的特异性和产量有显著影响。最后，通过加入双或三蒸水将反应体系调整至 100ul。

二、PCR 反应五要素

PCR 反应主要由五种物质组成，即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+。

引物是决定 PCR 特异性的关键因素。其长度通常在 15 - 30bp 之间，20bp 左右较为常用。合适的引物长度有助于确保特异性结合和高效扩增。引物扩增跨度以 200 - 500bp 为宜，这样可以在保证特异性的同时，实现对目标片段的有效扩增。引物碱基中 G + C 含量以 40 - 60%为宜，ATGC 最好随机分布，避免出现连续的 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列，以减少非特异性结合的风险。同时，要避免引物内部出现二级结构以及两条引物间互补，防止形成引物二聚体。引物 3`端的碱基应严格要求配对，否则可能导致 PCR 失败。

此外，引物中有或能加上合适的酶切位点，对于后续的酶切分析或分子克隆非常有好处。并且引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，以确保特异性。引物浓度也需谨慎控制，以最低引物量产生所需要的结果为好，浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，还会增加引物之间形成二聚体的机会。

酶在 PCR 反应中起着核心作用。目前主要有两种 Taq DNA 聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为 100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP 即脱氧核糖核苷三磷酸，在 PCR 反应中为 DNA 合成提供原料。dNTP 粉呈颗粒状，保存不当易变性失去生物学活性。应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris.HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50～200umol/L，并且 4 种 dNTP 的浓度要相等，任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低会降低 PCR 产物的产量，而浓度过高又会与 Mg2+结合使游离的 Mg2+浓度降低。

模板 DNA 是 PCR 反应的目标。传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本，提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。对于一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，同时要特别注意防止 RNase 降解 RNA。

 

Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有较大影响。在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。

三、PCR 反应条件设置

PCR 反应基于原理三步骤而设置变性 - 退火 - 延伸三个温度点。对于较短靶基因可采用二温度点法。

变性是 PCR 反应的一步骤，其目的是使双链 DNA 解链为单链。变性温度一般为 93℃～94℃，时间为 1min。变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。但温度也不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

退火是第2步，在这一步引物与模板发生结合。退火温度取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸，G+C 含量约 50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。退火温度可通过公式 Tm 值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)，复性温度=Tm 值-(5～10℃)来帮助选择合适的温度。在 Tm 值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

接下来是延伸，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。延伸温度一般选择在 70～75℃之间，常用温度为 72℃。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸时间可根据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb 以内的 DNA 片段，延伸时间 1min 是足够的。3～4kb 的靶序列需 3～4min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

总之，准确理解和掌握 PCR 反应体系与反应条件，对于成功进行 PCR 实验至关重要。只有在合适的反应体系和条件下，才能实现高效、特异性的 DNA 扩增，为后续的研究和应用提供可靠的基础。   

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