原代细胞的体外培养过程中，其生长时往往会混有多种不同类型的细胞。比如来自皮肤组织的细胞进行培养时可以出现表皮细胞与纤维下拨同时生长的情况。所以原代细胞的分离纯化在初期细胞培养时比较关键。

原代细胞的纯化方法主要有以下几种：

一、自然纯化法：

原代细胞由于具有较强的增殖能力，因此可以采用通过长期多代传代生物方式单独培养某一类型的目的细胞，靠自然优化的方式进行细胞纯化，这种方法的缺陷是无法按实验需求去自由去自由选择要培养的细胞。而且培养周期较长，适合应用于肿瘤细胞、成纤维细胞等细胞系建立使用。

二、人工纯化法：

人工纯化的方法在细胞纯化方面应用较为广泛，它是通过人工干预的方式，营造利于目的细胞生长的环境条件，从而抑制目的外细胞的生长从而达到细胞纯化的一种纯化方式。目前通用的主要有以下几种：

 酶消化纯化法：

根据上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受能力是不相同的，所以采用酶消化的方式可以使这两种细胞有效分开。这种纯化方法不仅适用于贴壁细胞，同样适用于半贴壁细胞和黏附细胞等。

操作步骤如下：

1.将0.25%胰蛋白酶分两次加入25ML的细胞培养瓶中，并轻摇匀。每次加入的量约为1ML左右，当胰蛋白酶覆盖细胞表面时，缓缓倒出。

2.拧上瓶盖进行细胞消化，在显微镜下观察到纤维细胞部分脱落时，即可加入培养基停止消化。

3.在培养瓶上标注不同类型的生长区域。加入培养基继续进行多次传代培养后即可分离。

机械刮分法：

在进行贴壁培养时，不同类型的细胞往往会成片区状混杂生长，我们可以使用细胞刮去除非目的细胞区域，具体操作步骤如下 ：

1.将培养瓶置于显微镜下，找出不同细胞类型的生长区域并用硅胶细胞刮划分非目的细胞使其悬浮于培养基中，操作是需要注意不要伤及目的细胞。

2.加入适量培养基进行冲洗，反而后继续加入培养基进行培养，如此反复多次即可达到纯化分离效果。

反复贴壁培养法：

由于成纤维细胞的贴附速度优于上皮细胞，一般情况下，10-30分钟即可完成贴壁过程，而上皮细胞则需较长时间才能完成贴壁生长。利用这一原理分离纯化细胞步骤如下：

1.在培养瓶内加入适量的培养基，混入细胞悬液常温下静置20分钟。

2.当显微镜下观察细胞开始出现贴壁时，缓缓摇动后，将细胞悬浮液，轻导另一个培养瓶中，重复第一步操作。

3.重复多次后即可实现细胞的纯化和分离。

原代细胞的分离和纯化对于后续的传代培养起着重要的作用，也会直接影响到细胞系的稳定性，所以也可以多种方法综合使用以增加细胞纯化力度，尽可能保证原代细胞的可靠一致性。

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