本节介绍细胞培养技术和简单的动物细胞培养步骤和方法。由于其中一些实验方法可能需要进行修改才能适应对应细胞类型的需求。

分离贴壁细胞进行继代培养

随着时间的推移，体外培养的细胞会耗尽培养基中提供的营养物质，释放有毒代谢物并持续增加。为了扩大和维持健康的细胞培养物，因此只能使用来自原始培养物的细胞亚群生产新的培养物，去除有毒副产物，并用新鲜培养基补充营养。这样的细胞培养方式叫做细胞的继代培养。

继代培养，细胞培养步骤：

当贴壁细胞的生长达到约 80% 的汇合度时，就达到了合适的传代时间。

1.此时的细胞可以被酶消化或机械解离以剥离它们的底物。在生物安全柜中，用不含 Mg 2+和 Ca 2+的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤细胞去除死细胞并在 37°C 下与足够的消化酶或螯合剂（例如胰蛋白酶、分散酶、胶原酶、乙二胺四乙酸 (EDTA)）一起孵育。

2.将锚定细胞从其底物和细胞间相互作用中分离所需的时间可能需要 1-60 分钟，这取决于细胞类型和使用的消化酶。可以在光学显微镜下监测解离的程度，一旦完成，轻敲培养容器应该会去除剩余的贴壁细胞。

3.分离的细胞收集在无菌的 离心管中，培养容器也应该用含有酶消化和细胞解离抑制剂的培养基清洗。

4.然后可以细胞计数仪对收集的细胞进行浓缩和计数。

5.以所需浓度接种在新的培养容器中。比如细胞培养生物反应器，较低的细胞浓度（~104 个细胞/mL) 适用于增殖速度快的细胞系，而较高的细胞浓度 (~10 5 个细胞/mL) 更适合于生长速度较慢的细胞。

 注意：良好的实验室习惯是记录自培养开始以来发生的传代次数。一些细胞系不适用于超过给定传代数的实验工作，因为随着时间的推移，哺乳动物系中的染色体异常往往会随着细胞分裂而增加。

悬浮培养物的继代培养

悬浮培养的继代培养可以通过无菌去除三分之一的细胞悬浮溶液并用预热的完全培养基替换体积来实现。

造粒细胞

为了浓缩细胞以转移到新的细胞培养容器、冷冻或其他实验测定中，将细胞悬液以 300 × g离心10 分钟。去除上清液后，通过轻轻上下吹打细胞 3 次，将细胞沉淀重新悬浮在所需培养基中。

注意：单细胞可能非常脆弱，因此建议不要以更高的速度离心或大力吸移它们。

细胞定量和确定细胞活力

细胞可能在培养过程中或在处理和传代过程中死亡。当依赖特定浓度的活细胞开始培养或需要特定数量的活细胞进行测定时，区分活细胞和死细胞很重要。在评估增长率时，细胞计数也很有帮助。由于细胞通常以数百万计培养，因此首先以小体积计算细胞数量，然后外推至整个细胞体积。为了实现这一点，细胞培养基技术中将所有细胞都被分离、沉淀并均匀地重新悬浮在合适的培养基体积中。在用 0.4% 台盼蓝 1:1 稀释时，将少量细胞悬液在离心管中混合。台盼蓝染料仅渗透无法存活的细胞，因此可以从后续定量中排除。

           这通过将 10 μL 台盼蓝中的细胞混合物加载到血细胞计数器上来实现。使用倒置显微镜、相差和至少 10 倍的放大倍率，对位于四个外部正方形中的所有细胞进行计数。活细胞包含较暗的“光晕”，而非活细胞则染成蓝色/黑色。为了确定活细胞的总数，在所有四个方格中发现的细胞数除以 4（以确定 1 mm 2中的平均细胞数），乘以 10 4（以获得每毫升的细胞数）乘以 2（以考虑台盼蓝的稀释因子）并乘以整个细胞悬浮液的初始培养基体积。活细胞的百分比可以通过将未染色的细胞数除以细胞总数，再乘以 100 来确定。健康细胞培养物的特征是 80-95% 的细胞活力。为避免步骤繁琐，也可以直接使用细胞活力ATP检测试剂盒。

 

上图中 使用台盼蓝进行细胞定量。  通过用盖玻片覆盖两个计数室来制备血细胞计数器。随后，将 10 μL 含有 0.4% 台盼蓝的 1:1 细胞悬液加载到其中一个计数室的填充槽口上。通过毛细作用，该体积将覆盖可以在至少 10 倍放大率的倒置显微镜中观察到的网格。覆盖正方形 A-D 的细胞的平均值决定了每 mm 2的细胞数。这些正方形中的活细胞通过排除由于通过其可渗透细胞膜吸收台盼蓝而呈现黑色的非活细胞来计数。仅应包括与外部水平和垂直边界之一重叠的单元格。

细胞冻存方法

如果在传代培养过程中有多余的细胞可用，则可以通过冷冻保护剂（例如甘油或二甲基亚砜 (DMSO)）将它们保存在该通道中，以防止有害的细胞外或细胞内晶体的形成。为此，细胞从培养容器中分离出来，并进行浓缩。将细胞沉淀重悬于 1 mL 冷冻培养基（例如补充有 10% DMSO 的敲除血清替代培养基）中，并将约 1 × 10 6 个细胞转移到每个冷冻管中。20-30 分钟后，冷冻保护剂将渗透到细胞中。在 -80°C 下以 1–2°C/min 的受控冷冻速率冷却过夜，然后将小瓶转移到液氮中进行长期储存。

       注意：虽然甘油和 DMSO 都是合适的冷冻保护剂，但需要仔细监控 DMSO 的处理。在高（原液）浓度下，DMSO 对人员和培养细胞有毒，因此未经事先稀释不能添加到细胞中。这种毒性也会影响含有 10% DMSO 的冷冻培养基中的细胞，如果在室温下放置数小时，则需要在 30 分钟内将细胞转移至 -80°C 进行储存。一般而言，应佩戴化学防护手套，以保护人员免受 DMSO 及其溶质容易穿透膜（包括皮肤）的危害。

解冻冷冻保存的细胞

大多数哺乳动物细胞可以在液氮（<130°C）中保存多年，因为所有生物过程都在这些温度下停止。为了回收细胞，将 10 mL 的完全培养基在水浴中预热。从液氮中取出冷冻小瓶后，立即将其放入 37°C 水浴中并轻轻旋转直至三分之二的内容物完全解冻。用 70% 乙醇擦拭小瓶并放入生物安全柜中，将 1 mL 预热的培养基以逐滴方式添加到部分解冻的小瓶中，以最大限度地减少 DMSO 稀释时施加在细胞上的渗透应力。现在完全解冻的小瓶的内容物也以逐滴方式转移到剩余的 9 mL 完全培养基中，并以 300 × g离心3分钟。吸出上清液后，细胞沉淀可在培养基中洗涤一次，以去除残留的冷冻保存剂。然后将细胞重新悬浮在完全培养基中并转移到细胞培养容器中。细胞附着应在 24 小时内发生。

       注意：冷冻保存后细胞的活力受到其应对冷冻和解冻压力源的能力的影响。因此，建议尽快执行解冻过程。当处理已经用甘油作为冷冻保护剂冷冻的冷冻管时，可以通过将冷冻保存的细胞直接稀释十倍到完全预热的培养基中来简化解冻过程，避免离心和洗涤步骤。

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