细胞类型和应用不同的细胞,培养步骤和方法也是不相同的。我们需要注意，如果细胞培养方法不合适，则细胞的特性可能会发生变化。这里介绍的是基本细胞培养过步骤，特殊的细胞需要特殊考虑。细胞培养步骤:

一、细胞的制备

图：通用细胞培养过程的流程图

获取细胞的方法：

一是从细胞库或从供体组织中分离细胞。当从细胞库获得的细胞开始培养时，需要经过“解冻”、“细胞接种”和“细胞观察”。

二是通过捐赠者收集。当使用从捐赠者那里收集的组织时，如果附着不需要的组织，通常会被移除。

从组织中分离细胞有两种主要方法，外植体培养法和酶法。在酶促方法中，使用蛋白水解酶溶液从目标组织中分离细胞。如果使用酶，稀释酶或用酶反应抑制剂终止酶反应，然后进行“细胞接种”和“细胞观察”准备  细胞培养。

二、细胞解冻

解冻冻存的细胞来进行细胞培养的步骤也被称为：“唤醒细胞”。

细胞解冻的具体方法如下：

1. 从细胞库获得的一小瓶冷冻细胞，从液氮罐*1或超低温冷冻箱（-150℃）转移到合适的冷藏容器，如液氮容器，运至工作台，解冻可置于 37°C 水浴锅中进行。

2. 在冰快融化前，快速加入培养基稀释冷冻保护液（EX.DMSO），离心沉淀细胞，去上清后加入预热至37℃的新鲜培养基。然后通过移液将细胞重新悬浮，并使用显微镜或细胞计数仪来测量细胞数量/细胞浓度。

细胞冻存注意事项：

A.在液氮罐中冷冻保存细胞有两种方法：使用液氮冷气的“气相”和将冷冻保存物直接浸入液氮中的“液相”。在液相的情况下，它可以保存在-196°C，这是液氮的温度，但液氮进入冷冻小瓶并被细菌、酵母、支原体污染的风险很高，和来自其他小瓶的病毒。因此，强烈建议在气相中储存。
B. 如果将保存在液相中的小瓶放置在 37°C 水浴或熔化装置中，小瓶中留有液氮，则小瓶可能会爆裂。在将其放入 37°C 水浴之前，应将盖子松开一次并重新拧紧。

三、细胞接种和培养：

实现目标细胞接种密度，计算达到所需的新鲜培养基的量 细胞接种根据测量的细胞数确定密度，并相应地稀释细胞悬液。

1.细胞观察

将细胞接种到新的培养容器中后，用光学显微镜或细胞显微成像仪观察：

A.检查是否有活细胞

B.检查以确保细胞均匀分布在容器中

C.检查是否存在细胞以外的异物

D.检查细胞形态，通过检查细胞形态和状况来确定细胞类型和培养培养条件，有些情况下需要静置两天。

以上确认无误后，将细胞置于 CO2培养箱中，37°C 开始培养。

2.介质更换：

解冻并接种到培养皿中后，细胞开始 CO2摇床中培养. 此时，细胞会代谢培养基中的营养物质，因此必须用新鲜培养基替换已经耗尽营养物质并富含代谢物的培养基。这个过程称为“介质更换”或“介质更换”。

在更换培养基之前，需要观察细胞来验证培养是否正常进行。去除旧培养基后，迅速加入新培养基以防止细胞变干。有些细胞如果不浸入培养基可能会死亡，所以有些情况下会留下少量旧培养基而不是完全丢弃。此外，应将新鲜培养基预热至 37°C，以免细胞暴露于温度突然变化的环境中。

更换培养基后，检查细胞是否有任何损坏迹象。使用显微镜获取培养物的图像，以证明其进展顺利，然后将其送回培养箱，注意尽量减少不必要的干扰。

3. 细胞传代培养：

    一旦细胞开始增殖，在当前容器变满之前将它们分成新的培养容器。这称为“细胞传代”。细胞生长充满培养容器的状态称为“汇合”。通常，建议当细胞占据的面积达到容器的大约 70% 到 80% 时进行细胞传代。 当它们汇合时，细胞会相互接触并感觉它们不再需要生长，这种现象称为“接触抑制”，特别是在正常细胞的情况下，它们在传代后将不再增殖。如果是癌细胞的话，它会继续快速增殖，容易造成营养缺乏，所以需要实时观察和监测细胞生长。

四、细胞传代培养

悬浮细胞和贴壁细胞的传代方法有所不同。

1.悬浮细胞的传代培养：

细胞培养步骤：收集的细胞培养悬浮到试管中并离心以收集细胞。去除上清液，留下细胞沉淀，并重新悬浮在新鲜培养基中。取部分新鲜悬液，涂上活体染色台盼蓝，计数活细胞数。计算细胞浓度，考虑细胞稀释方法，适当调整悬液中细胞的密度，放入培养瓶中。

2.贴壁细胞的传代

粘附在培养容器表面的细胞需要以某种方式从其表面分离。一般使用胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等蛋白酶。在胰蛋白酶的情况下，钙或镁离子会抑制活性，因此在使用前必须清洗含 有这些离子的培养基。相反，胶原酶和分散酶在钙离子存在下表现出活性。

贴壁培养步骤如下：

1.去除旧培养基上清液。如有必要，用磷酸盐缓冲液或新鲜培养基清洗

2.添加细胞分散酶溶液。在酶活性范围内的预定温度下稳定预定时间以促进酶促反应。

3.显微镜下检查细胞脱离程度。

4.通过轻微的机械干扰，如敲击等促进细胞脱离。如果酶的终止溶液可用，添加它以终止反应。如果不能用，可以添加新鲜培养基以稀释酶并降低活性，通过多次吸取培养基，将细胞分离成单细胞悬液。

5.收集含有细胞的培养基，离心沉淀细胞，去除含有酶和反应终止液的上清液。

6.向收集的细胞管中加入新鲜培养基

7.通过上下吹打重悬细胞

8.取细胞悬浮液样品通过细胞计数仪或细胞成像系统来计算细胞数和细胞密度

9.确定好细胞密度和细胞的正确稀释度，加入适量的新鲜培养基，并重新悬浮细胞

将预定量的细胞悬液接种到新的培养容器中。

10.进行显微镜观察

11.转移到 CO 2振荡培养箱中，设置为 37 °C 的温度，振荡培养。

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