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细胞复苏操作步骤与详细方法指南
来源: 细胞培养基 时间:2025-08-08
细胞复苏全过程:
细胞复苏是将休眠的细胞重新活化,使之重新生长,进入细胞周期,进而分裂产生子细胞的过程。细胞复苏后,可进入细胞周期,重新获得细胞类型特异的生物学功能。
一、 实验前准备
实验开始前,将无菌培养瓶,15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台,以紫外线照射 30min。然后,采用通风机通风 3min。以 75%酒精擦拭操作台和双手。
准备好冰盒。
将离心机调节至 800rpm,5min。水浴箱调节至 37 度恒温。取细胞完全培养基,放于水浴箱中预热。
消毒双手和超净台。取约 10ml 细胞完全培养基放于 15ml 离心管中。
HEK293T细胞
实验前备冰盒,快速由液氮中取出冻存的细胞,置于冰盒内。然后迅速将冻存管投入到已经预热到 37 度的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化,注意管口处高于水面,以免进入导致污染。整个解冻过程最好在 1 分钟以内,以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞,约 1min 后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精喷拭冻存管的外壁,立即拿入超净台内。
二、制备细胞悬液

以无菌枪头吸取细胞冻存液,置于已放入细胞完全培养基的离心管中,上下吹打 5 次,使冻存液与完全培养基充分混匀,尽量减少冻存液中 DMSO 的浓度,减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。

配平离心:采用天平配平两端,800rpm,室温离心 5min。

三、细胞计数
采用细胞计数仪 快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入 10ml CASY-ton 至以标记 viable 的管子中,加入 100ul 细胞悬液,颠倒混匀三次,可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞 2 乘 10 的 5 次方.
四、细胞培养
离心后,吸弃上清液,不要吸到底部的细胞沉淀。根据计数结果,向离心管内的细胞沉淀加入 10ml海星细胞完全培养基,反复吹打制成细胞悬液,吹打过程中尽量不要产生气泡。符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,左右轻轻摇动培养瓶,把细胞摇均匀,将NEST培养瓶放入 37℃,5%CO2 的培养箱中培养, 2-4 小时或者 24-48 小时后换液继续培养,换液的时间由细胞情况而定,一般以大部分细胞状态良好时换液为宜,比如超过半数的细胞贴壁,
即可换液。
细胞株
五、注意事项
1、取冻存管要做好保护措施
取细胞的过程中未带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸,当然,选择好的冻存管此状况一般不会发生。
2、解冻速度要快
在常温下,冻存液中的 DMSO 对细胞的毒副作较大,因此,必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤。
3、细胞贴壁少
一般冻存细胞解冻时 1ml 细胞液要加 10ml-15ml 培养液,培养基加入过多,造成细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁,所以进行细胞的计数尤为重要。
4、一次复苏细胞不宜过多
细胞在解冻时,水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。正
规来说,需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多,容易忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。
更多防止细胞污染实验室 仪器设备 > 干式细胞复苏仪

干式细胞复苏仪

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