建立石蜡/新鲜组织总RNA提取操作规程。

范围：

适用石蜡/新鲜组织总RNA提取的操作。

职责：

研发实验室负责人负责维护本制度的适用性和执行有效性，并对RNA提取的质量进行监督。

内容：

实验前试剂材料准备与检查工作如下：

1. 图1：天根提取试剂盒
   
2. 
   
3. RNA提取试剂盒（天根；常温放置）
4. 裂解液RL
5. RNase-Free DNase I干粉(天根；保存
   在2-8℃)

无水乙醇；

1. β-巯基乙醇
2. RNase-free高压灭菌的1.5ml EP管；
3. RNase-free高压灭菌的各类移液枪头；
4. RNase-free水。

操作步骤

第一部分:组织前处理：

1. 石蜡组织前处理：
2. 取1ml二甲苯置于1.5ml EP管中，用管中二甲苯冲淋玻片，在湿润时用刀片刮取石蜡组织至EP管中，共刮取4至8片石蜡玻片(或切取2-8片5-15 µm厚的石蜡切片)，不超过8片；
   

图2：石蜡玻片组织样本处理

图3：石蜡包埋组织样本处理

1. 震荡混匀器上强力振荡20s，18000rpm室温离心3min，用微量移液器去除上清，小心不要移走沉淀的组织块(可以适情况重复上面步骤一次)；
2. 加1ml无水乙醇至EP管，震荡混匀后，18000rpm室温离心3min，移除上清，小心不要移走沉淀的组织块；
3. 打开管盖，37℃挥发5-10min(或至酒精均已挥发无酒精味)；
4. 新鲜组织前处理：

采用一次性的剪刀或刀片将新鲜组织块（10-20mg）在含有300μl裂解液RL（使用前检查是否加入1%的β-巯基乙醇）的灭菌1.5mLEP管中分割成小组织块（尽量减碎）。

第二部分：组织消化：

1. 石蜡组织消化：加入200ul裂解液RF 以及10ul蛋白酶K 于沉淀中，彻底涡旋混匀；55℃孵育30～60 min 之后80℃孵育15 min。
2. 新鲜组织消化：加入590ulRNase-Free ddH2O和10ul蛋白酶K于沉淀中，混匀后56℃处理60min。

图4：组织消化

第三部分：RNA吸附

1. 室温(20-25℃)，12,000 rpm(～13,400×g)离心5 min，转移上清入新的RNase-free离心管中；
   

图5：转移上清

1. 石蜡样本：加入220ul的缓冲液RB，涡旋混匀，加入660ul的无水乙醇；新鲜组织：缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇。
   

图6：加入0.5倍上清体积无水乙醇

1. 混匀（此时可能出现沉淀），转移700μl溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12,000 rpm(～13,400×g)离心30～60 sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
   

图7：混合液转移

1. 重复上一步骤，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

第四部分：DNase消化：

1. 向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1，12,000 rpm(13,400×g)离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。（对于新鲜组织，此步骤可以省去）；
   

图8：去蛋白液洗涤

1. DNase I储存液的配制：将DNase I干粉溶解在500ul RNase-free水中，轻柔混匀，分装（50ul/管）后-20℃储存（可保存9个月），每次按照实验要求取出。请注意将融化的DNase I的储存液置于4℃储存（可保周），请勿再次冻存；
   

加水
揭盖
轻柔混匀

分装
-20℃储存（可保存9个月）
图9：DNase储存液配制

1. DNase I工作液的配制：取50ulDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入350 ulRDD溶液，轻柔混匀；
   

图10：DNase工作液配置

1. 向吸附柱CR3 中央加入80ul的DNase I 工作液，室温放置15min；

图11：DNase室温消化15min

第五部分：RNA洗脱

1. 向吸附柱CR3 中加入500ul去蛋白液RW1，室温(20~25℃)，12,000rpm(～13,400×g) 离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
2. 向吸附柱CR3 中加入500ul漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇）， 室温静置2min，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60s，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
   

图12：漂洗液RW洗涤

1. 重复上述步骤；
2. 室温(20~25℃)，12,000 rpm(~13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
3. 将吸附柱CR3 转入一个新的RNase-free 离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100ulRNase-free ddH2O，室温放置2min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2min，得到RNA 溶液。
4. 在管壁和管盖上标清样本唯一性编号；
5. 将RNA用于后续操作或冻存在-80℃；
6. 及时做好纸质和电子文档记录。

第六部分 RNA质量检测

1. 完整性：琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。由于固定和包埋的条件限制，FFPE样本核酸通常发生片段化并且会被甲醛化学修饰，因此较难提取，本试剂盒提取的RNA可应用于RT-PCR等下游试验。
   

图13：漂洗液RW洗涤
该试剂盒能可从新鲜组织中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。提取的总RNA纯度极高，没有蛋白质和其他杂质污染。例如利用该试剂盒分离大鼠不同组织总RNA， 琼脂糖凝胶电泳结果显示，在7~15kb处，高分子RNA（mRNA和 hnRNA）呈不连续的带状分布，在5kb（28S）和2kb（18S）有两条主要条带。

1.      纯度分析：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD260/OD280 读数在1.8-2.1 之间，比值为2.0 是高质量RNA 的标志。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
2. 
   
3. 苏州阿尔法生物提供的天根试剂盒包括DNA提取试剂盒，RNA提取试剂盒，质粒小提试剂盒，胶回收试剂盒，ELsias试剂盒等。所有产品均低于天根官网的目录价，详细了解拨打0512-62956104或18934597460.
   
4.