人多能干细胞（hPSC）具有自我更新和分化为各种细胞类型的潜能，为医学、药物研发和生命科学研究提供了不少贡献。近年来，随着生物技术的发展，hPSC的培养技术不断优化，其中多层细胞工厂作为一种高效的2D培养方法，逐渐受到研究者的关注。本文将为您揭秘如何通过多层细胞工厂进行hPSC的2D培养。

一、多层细胞工厂的优势

1. 高密度培养：多层细胞工厂采用层叠式设计，可充分利用空间，实现细胞的高密度培养，提高产量。

2. 易于操作：细胞工厂的操作简便，便于规模化生产。

3. 条件均一：细胞工厂内环境稳定，有利于细胞生长和分化。

4. 产量可控：通过调整细胞工厂的层数，可轻松实现产量的调控。

二、如何通过多层细胞工厂进行hPSC的2D培养

1. 细胞接种

将hPSC接种到预先处理过的细胞工厂中，确保细胞均匀分布。接种密度可根据实验需求进行调整。

2. 日常培养

接种后第1、3和4/5天进行补料，监测配套烧瓶以确定最佳收获日期（≥ 90%汇合度）。具体操作如下：

（1）将废培养基倒入废液瓶中，更换新鲜培养基。

（2）更换培养基后放回培养箱。

3. 收获细胞

当配套烧瓶汇合度达到90 - 95％时（接种后第5 - 6天）收获细胞工厂的hPSC。具体步骤如下：

（1）将用过的培养基倒入废液瓶中。

（2）用200 mL PBS冲洗细胞工厂。

（3）添加200 mL TrypLE™ Express或0.25%胰蛋白酶-EDTA。

（4）37°C孵育8 - 10分钟。

（5）将200 mL ACF酶抑制溶液或TeSR™-AOF添加到烧瓶中，混匀后倒入无菌1 L瓶中。

（6）用400 mL无菌PBS冲洗细胞工厂，倒入同一无菌收集瓶中。

（7）将细胞悬浮液分装到离心管中，离心后去除残留的解离试剂，重新悬浮并汇集细胞。

三、实验结果

1. 未分化状态的标志物表达

从细胞工厂收获的hPSC表达了未分化状态的标志物，如OCT-4和TRA-1-60，超过90%的细胞均表达这两种标记物。

2. 冷冻后仍保持高活力并有效附着

从细胞工厂收获的单细胞hPSC在-135°C的FreSR™-S中冷冻后，仍保持高活力并有效附着。

3. 三谱系分化

从细胞工厂收获的hPSC具有三谱系分化能力，可分化为定形内胚层、早期中胚层和神经祖细胞。

4. 保持正常核型

从细胞工厂收获的hPSC保持正常核型，扩大培养规模后，细胞未检测到额外的拷贝数变异。

通过本文的介绍，相信您已对如何通过多层细胞工厂进行hPSC的2D培养有了深入了解。多层细胞工厂作为一种高效的2D培养方法，为hPSC的研究和应用提供了有力支持。在今后的研究中，多层细胞工厂将继续发挥其优势，助力hPSC领域的发展。

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