PCR 或聚合酶链式反应是分子生物学中用于创建特定 DNA 片段的多个副本的技术。这项技术是由USA生物化学家 Kary Mullis 于 1983 年开发的。通过PCR仪进行PCR 使产生数百万份 DNA 小片段成为可能。所以PCR仪也是分子生物学和生物技术实验室常用于见的实验室设备。
PCR的原理
PCR 技术基于 DNA 的酶促复制。 在 PCR 中，使用引物介导的酶扩增一小段DNA 。DNA 聚合酶合成与模板 DNA 互补的新 DNA 链。DNA 聚合酶只能将核苷酸添加到预先存在的 3'-OH 基团上。因此，需要一个底漆。因此，更多的核苷酸被添加到 DNA 聚合酶的 3'''末端。
PCR实验主要由三部分所组成：
1.DNA 模板– 样本中单链DNA。
2.DNA 聚合酶–使用 Taq 聚合酶。Taq聚合酶属于热稳定酶，在较高的温度下不会变性。
3.寡核苷酸引物s - 这些是与单链和反链的 3' 末端互补的短链单链 DNA。
4.脱氧核糖核苷酸三磷酸——它们为聚合提供能量，是 DNA 合成的基石。
5.缓冲系统——镁离子和钾离子为 DNA 变性和复性提供了良好的环境条件。它对于保真度、聚合酶活性和稳定性也很重要。
PCR的基本类型
PCR有以下几种类型：
1.实时荧光定量 PCR
实时荧光定量 PCR，在荧光检测系统的帮助下实时检测 DNA 扩增。荧光报告基因的信号强度与扩增的 DNA 分子数量成正比。该实验中所使用的PCR仪器一般是荧光定量PCR仪。比如：朗基的A600 PCR仪。
2.嵌套 PCR
通过嵌套PCR可以提高样本的敏感性和特异性。由于意外引物结合位点的扩增，减少了产物的非特异性结合。
3.多重PCR 使用多通道高通量的PCR仪可以实现同时扩增许多不同的 DNA 序列。也可以用于在单个 PCR 实验中扩增多个目标。比如朗基的T30系列PCR仪。
4.定量 PCR
定量PCR主要用于通过 DNA 扩增线性来检测、表征和量化样品中的已知序列。
PCR基因扩增步骤
PCR PCR基因扩增主要经过3个循环反应：
变性
当反应混合物加热至 94℃ 约 0.5 至 2 分钟时发生变性。这会破坏两条 DNA 链之间的氢键并将其转化为单链 DNA。此时，单链作为产生新 DNA 链的模板。此阶段应提供较长时间的温度以确保DNA链的解离。
退火
通过PCR仪设定的程序将反应温度降至54-60℃约20-40秒。在这里，引物与模板 DNA 上的互补序列结合。引物是长度约为 20 至 30 个碱基的 DNA 或 RNA 的单链序列。
引物是 DNA 合成的起点。DNA链分开后以相反的方向运行，因此引物设计一般有两个，即：正向引物和反向引物。
延伸
在这一步，温度升高到72-80℃。Taq 聚合酶将碱基添加到引物的 3' 端。
这会在 5' 到 3' 方向上拉长 DNA。DNA聚合酶在适宜的温度下增加约1000bp/分钟。
Taq 聚合酶可以耐受较高的温度。它附着在引物上并将 DNA 碱基添加到单链中。从而获得了双链DNA分子。
这三个步骤一般重复 20-40 次，即可在短的时间内获得许多目标的 DNA 序列。
PCR技术的应用
PCR技术主要应用于以下领域：
l 药物
l 遗传病突变检测。
l 基因检测
l 检测父母的致病基因。
l 法医学
l 用作基因指纹识别的工具
l DNA鉴定
l 亲子鉴定
l 研究和遗传学
l 在基因组研究中比较两种生物的基因组
l 用于任何来源（例如化石）的 DNA 的系统分析
l 基因表达分析
l 基因图谱构建
PCR实验中常见问题及解决方案
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PCR实验中常见问题汇总 |
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问题及现象 |
原因 |
解决方案 |
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1. PCR 后，管中的液体较少。 |
样品挥发，损失 |
确保加热的盖子达到适当的温度。 |
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吸取样本后，尽快盖上PCR 管的盖子。防止挥发。 |
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移液不准确 |
确保吸取 20 µL 引物混合物和 5 µl Lambda DNA 模板到 PCR 管中。样本量少时需要采用高精度移液器。 |
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2.在 QuickStrip 中没有足够的样本 |
QuikStrip 已变干。 |
加入 40 μL 水，在装载前轻轻上下移液以混合均匀。 |
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3.电泳凝胶上看不到条带、对照 DNA 和PCR 产物 |
凝胶未正确制备。 |
确保正确稀释电泳缓冲液。 |
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融化琼脂糖时需要特别注意较高浓度 (>0.8%) 的凝胶。在倒入凝胶之前，确保溶液完全没有“团块 ”和玻璃状颗粒，也可以直接使用配置好的预制胶。省时省力。 |
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凝胶未正确染色。 |
染色时注意浓度，实在不行就重新染色。 |
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电泳装置或电源出现故障。 |
请联系电泳仪或电泳设备供应商，帮忙排除故障 |
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4.凝胶染色后，DNA 条带模糊。 |
凝胶没有染色足够长的时间。 |
严格按照染色流程说明进行实验操作。 |
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5.染色后，条带可见，但不存在 PCR 产物。 |
PCR扩增不成功。 |
注意引物设计是否合理，DNA聚合酶的加入量是否适宜。 |
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确保PCR的正确操作，温度设计是否合理。 |
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6.染色后，凝胶上可见条带和对照 PCR 产物，其中一部分样品不存在。 |
PCR 反应中添加了错误体积的 DNA 和引物。 |
熟练使用移液器进行精准移液定量，确保移液的准确度 |
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