DNA聚合酶是实验室中常用的生物学酶之一，在PCR实验中具有重要的作用。实验室常用的DNA聚合酶，包括Taq聚合酶、Pfu聚合酶和Tth聚合酶。
一、Taq聚合酶：
Taq聚合酶是由Thermus aquaticus细菌产生的一种DNA聚合酶，在分子生物学研究中得到广泛应用。Taq聚合酶具有热稳定性，可以在高温条件下保持活性，这是由于其来源于热液生物，能够存活和正常活动于高温环境。这使得Taq聚合酶在聚合酶链式反应（PCR）中起到关键的作用。Taq聚合酶能够按照DNA模板合成新的DNA链，因此在PCR中用于扩增目标DNA片段。然而，Taq聚合酶缺乏3'-5'外切酶活性，导致其生成的PCR产物末端容易出现额外的腺嘌呤碱基。因此，在某些应用中，需要使用具有外切酶活性的聚合酶。
二、Pfu聚合酶：
Pfu聚合酶是由Pyrococcus furiosus细菌产生的一种DNA聚合酶。与Taq聚合酶相比，Pfu聚合酶具有更高的热稳定性和耐酶性。这使得Pfu聚合酶在高温PCR反应中表现出色，其高度稳定的酶活性能够确保PCR反应的可靠性和准确性。此外，Pfu聚合酶还具有3'-5'外切酶活性，可以修复并纠正PCR反应中的腺嘌呤碱基误配，有效防止误差累积。因此，Pfu聚合酶适用于需要高度准确的PCR扩增和DNA测序。
三、Tth聚合酶：
Tth聚合酶是由Thermus thermophilus HB8细菌产生的一种DNA聚合酶。与Taq聚合酶和Pfu聚合酶不同，Tth聚合酶具有热活性反转转录酶活性，可以将RNA模板合成相应的DNA链。因此，Tth聚合酶在逆转录PCR（RT-PCR）中得到广泛应用，用于将RNA转录成DNA，并通过增加热活性酶来实现PCR扩增。此外，Tth聚合酶还具有一定的外切酶活性，可用于修复和校正PCR产物的末端。
这三种酶的主要区别在于：Taq聚合酶适用于普通PCR扩增；Pfu聚合酶适用于需要高准确性的PCR扩增和DNA测序；Tth聚合酶适用于逆转录PCR。根据实验的目的和需求，选用适当的DNA聚合酶有助于确保实验数据的准确性和可靠性。
1. 按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液：
TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方
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Reagent |
Quantity, for 50µl of reaction mixt ure |
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10X PCR buffer （ Mg2+ free） |
5 µ l |
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MgCl2（25 mM） |
如 TaKaRa Taq TM 加 3 µl |
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如 TaKaRa EXTaqTM 加 4 µl |
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2.5mM dNTP mix |
4 µ l |
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10µM Primer 上游 |
1 µ l |
|
10µM Primer 下游 |
1 µ l |
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Template DNA |
1 µ l |
|
Taq 或 E XTaqDNA Polymerase |
0.25 µl |
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Sterile deionized water |
Up to 50µl |
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Total |
50 µl /Sample |
PCR实验中Pyrobest TM DNA Polymerase 的配方
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Reagent |
Quantity, for 50µl of reaction mixture |
|
10X Pyrobest buffer |
5µ l |
|
2.5mM dNTP mix |
4µ l |
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10µM Primer 上游 |
1µ l |
|
10µM Primer 下游 |
1µ l |
|
Template DNA |
1µ l |
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Pyrobest TM DNA Polymerase |
0.25µl |
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Sterile deionized water |
Up to 50µl |
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Total |
50µl /Sample |
① 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 20~50µl 以节约试剂；
② 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中；
③ 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 ~50µl 的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发；
2. 按以下程序进行 PCR 扩增。
PCR实验中PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件，PCR仪的不同而各异， 在实际操作中需根据具体的情况以及 PCR 结果而进行优化。
|
Step |
Temperature, ° C |
Time, min |
Number of cycles |
Note |
|
起始变 性 |
94~95 |
1-3 |
1 |
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变性 |
94~95 |
0.5-2 |
25-35 |
退火温度比理论退火 温度大概低 5°C ，再 根据反应结果优化 |
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退火 |
37-70 |
0.5-2 |
||
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延伸 |
70-75 |
根据扩 增产物 的大小 |
每分钟延伸 1000bp |
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|
最终延 伸 |
70-75 |
10 |
1 |
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使用朗基PCR仪进行PCR反应实验结束后，抽取扩增样品 5µl，用天能琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用 DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
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