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PCR检测方法有很多,其中PCR扩增仪又称为“PCR仪”,它是PCR实验中不可缺少的实验室设备之一。PCR仪器大致可以分为三类:即:普通PCR仪,荧光定量PCR仪,梯度PCR仪和原位PCR仪等。
一、PCR的原理
在pcr扩增实验中,PCR反应过程实质就是DNA按模板复制而发生的聚合酶链反应的过程,主要包括引物、dNTP、DNA靶序列、DNA聚合及PH缓冲液体系。
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PCR反应过程如下:
1.通过升温反应体系混合物一般为:94℃/15s-30s.使目标DNA双螺旋的氢键产生断裂从而形成单链DNA作为合成模板.
2、在反应体系冷却至引物的TM值左右,使引物与单链DNA模板产生互补结合,从而实现DNA的互补扩增,这一过程也被称之为退火。
3、扩增延伸
在PCR扩增过程中,当反应体系的温度升高到72 ℃左右时,引物在TAQ聚合酶的作用下,以引物为起点dNTP作为底物合成新的DNA链条。
以上步骤重复循环,直扩增量达到基因检测的所需要数量即可停止循环。
使用PCR扩增仪进行PCR反应过程中常见的问题:
无明显的扩增条带
这种情况主要是由于以下情况产生:
(1)Taq酶失活或Taq酶活性加入量少所造成。DNA聚合Taq酶的保存温度一般在-20℃环境下,尽量避免反复冻融所产生的影响。
(2)混合模板反应体系中如果含有甲酸、甲醛含等杂质也会对DNA链上的碱基造成影响,降低PCR扩增效果。
(3)PCR仪的各反应阶段适宜温度设定也很重要,过高或过低的反应温度,都会使DNA聚合酶产生失活。
(4)引物设置不合理或反应系统中被蛋白酶及核酸酶,这些因素也同样会影响到DNA的合成与产出。
(5)另外,PCR循环数不足或者延伸扩增时间短也会影响到PCR产物产量。
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