PCR标准操作流程详解

一、概述

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在体外合成双链DNA的技术。其原理模仿了天然DNA的复制过程，通过特异引物和高特异性酶，确保反应的特异性。典型的PCR反应包括三个步骤：变性、退火和延伸，通过多次循环，最终获得目标DNA片段。

二、试剂准备

以下为进行PCR反应所需的试剂及其终浓度：

三、操作步骤

1. 配置反应体系

将以下成分按顺序加入0.5ml的离心管中：

l 加入PCR buffer。

l 加入dNTPs。

l 加入Forward primer。

l 加入Reverse primer。

l 加入Template DNA。

l 加入热启动酶。

l 用ddH2O补至总体积50 ul。

注意：使用热启动酶时，可在常温下操作；非热启动型酶需在低温下配置反应体系。 

2. 设置反应条件

根据试剂盒说明书设置反应时间和温度，完成扩增后进行电泳鉴定。

3. 琼脂糖核酸电泳

①　准备电泳器具，用蒸馏水洗净并架好梳子。

② 根据所需分离的DNA片段大小，制备适当浓度的琼脂糖凝胶。

③ 将琼脂糖和电泳缓冲液（TAE或TBE）加入锥形瓶中，加热融化后冷却至40℃左右，混匀并倒入电泳槽。

④　室温下凝固凝胶，拔出梳子，准备点样。

⑤　在电泳槽中加入电泳缓冲液，确保覆盖凝胶表面。

⑥ 混合5ul样品、1ul的6xLoding buffer和1ul染料，缓缓注入点样孔，避免串孔。

⑦ 接通电源（红正黑负），设置电压40-60V，电泳时间30-40min，根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳。

⑧ 电泳结束后，关闭电源，进行凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小。

不同琼脂糖浓度对应的DNA片段大小如下表：

四、注意事项

引物设计

Ø 引物应设计在cDNA的保守区域。

Ø 引物长度应在15-28bp之间。

Ø GC含量应在40%-60%之间。

Ø 避免引物自身形成发夹结构，完成后进行BLAST验证。

模板DNA

Ø 模板可以是单链或双链DNA。

Ø 不同来源的模板起始浓度有一定要求。

Ø 模板提取后应注意保存，避免降解。

其他

Ø 选择合适的Taq DNA聚合酶。

Ø 确保四种dNTP浓度相同。

Ø 操作过程中戴手套，保持环境干净，防止污染。

Ø PCR用水需经过高压灭菌或0.2um滤膜过滤。

五、常用试剂配方

电泳缓冲液

50xTAE（pH8.5）

Tris 242g

EDTA（Na）37.2g

Ø 加入800ml去离子水，搅拌溶解

Ø 加入57.1ml乙酸，调pH至8.5后定容至1L

10xTBE（pH8.3）

Tris 108g

EDTA 7.44g

硼酸55g

Ø 加入800ml去离子水，搅拌溶解，调pH至8.3后定容至1L

上样缓冲液（6xLoding buffer）

0.25%二甲苯青

0.25%溴酚蓝

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