PCR标准操作流程详解

一、概述

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在体外合成双链DNA的技术。其原理模仿了天然DNA的复制过程，通过特异引物和高特异性酶，确保反应的特异性。典型的PCR反应包括三个步骤：变性、退火和延伸，通过多次循环，最终获得目标DNA片段。

二、试剂准备

以下为进行PCR反应所需的试剂及其终浓度：

三、操作步骤

1. 配置反应体系

将以下成分按顺序加入0.5ml的离心管中：

l 加入PCR buffer。

l 加入dNTPs。

l 加入Forward primer。

l 加入Reverse primer。

l 加入Template DNA。

l 加入热启动酶。

l 用ddH2O补至总体积50 ul。

注意：使用热启动酶时，可在常温下操作；非热启动型酶需在低温下配置反应体系。 

2. 设置反应条件

根据试剂盒说明书设置反应时间和温度，完成扩增后进行电泳鉴定。

3. 琼脂糖核酸电泳

①　准备电泳器具，用蒸馏水洗净并架好梳子。

② 根据所需分离的DNA片段大小，制备适当浓度的琼脂糖凝胶。

③ 将琼脂糖和电泳缓冲液（TAE或TBE）加入锥形瓶中，加热融化后冷却至40℃左右，混匀并倒入电泳槽。

④　室温下凝固凝胶，拔出梳子，准备点样。

⑤　在电泳槽中加入电泳缓冲液，确保覆盖凝胶表面。

⑥ 混合5ul样品、1ul的6xLoding buffer和1ul染料，缓缓注入点样孔，避免串孔。

⑦ 接通电源（红正黑负），设置电压40-60V，电泳时间30-40min，根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳。

⑧ 电泳结束后，关闭电源，进行凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小。

不同琼脂糖浓度对应的DNA片段大小如下表：

四、注意事项

引物设计

Ø 引物应设计在cDNA的保守区域。

Ø 引物长度应在15-28bp之间。

Ø GC含量应在40%-60%之间。

Ø 避免引物自身形成发夹结构，完成后进行BLAST验证。

模板DNA

Ø 模板可以是单链或双链DNA。

Ø 不同来源的模板起始浓度有一定要求。

Ø 模板提取后应注意保存，避免降解。

其他

Ø 选择合适的Taq DNA聚合酶。

Ø 确保四种dNTP浓度相同。

Ø 操作过程中戴手套，保持环境干净，防止污染。

Ø PCR用水需经过高压灭菌或0.2um滤膜过滤。

五、常用试剂配方

电泳缓冲液

50xTAE（pH8.5）

Tris 242g

EDTA（Na）37.2g

Ø 加入800ml去离子水，搅拌溶解

Ø 加入57.1ml乙酸，调pH至8.5后定容至1L

10xTBE（pH8.3）

Tris 108g

EDTA 7.44g

硼酸55g

Ø 加入800ml去离子水，搅拌溶解，调pH至8.3后定容至1L

上样缓冲液（6xLoding buffer）

0.25%二甲苯青

0.25%溴酚蓝

     苏州阿尔法生物是一家集生命科学仪器设备、实验耗材和实验试剂供应于一身的专业公司。阿尔法生物产品覆盖生命科学研究、生物制药、环境监测、食品安全等领域，包括的实验室仪器设备有生物显微镜、细胞培养系统、蛋白电泳系统、数字PCR仪、荧光定量PCR仪、退PCR仪、三槽PCR仪、高通量分析仪、高速冷冻离心机、超速离心机、台式高速离心机、低速离心机、落地式离心机、迷你离心机、真空浓缩仪、恒温恒湿培养箱、生物反应器、细菌培养箱研磨仪等，实验耗材常用的 nest培养瓶、rainin移液枪tip头、离心管、PCR 管、8联排管、三角摇瓶、培养皿等，实验试剂包括天根试剂盒、质粒抽提试剂盒、蛋白抗体、碧云天试剂、阿拉丁试剂、肿瘤细胞株、基因编辑细胞、支原体清除试剂盒等。阿尔法生物一直与国际生命科学仪器厂商以及一些新兴科技公司保持着深度的合作关系，这也为产品供应和技术支持提供了有力保障。 作为十四年年专注于实验室仪器设备、实验耗材和实验试剂供应商，无论是实验室的常规使用，还是科研人员的前沿探索，阿尔法生物都能够为您提供良好的软硬件支持和快捷、周到的服务。更多实验室仪器、实验试剂、实验室耗材采购相关问题可以0512-62956104 或18934597460。