昆虫细胞质粒DNA提取和酶切是一种常用的实验方法,用于研究昆虫基因组和基因功能。昆虫细胞需要被裂解,释放DNA。接着,使用DNA提取试剂盒提取DNA,纯化得到目标DNA。然后,通过酶切反应使用限制性内切酶对DNA进行切割。这些步骤将可用于进一步的实验,如PCR扩增和DNA测序,以研究昆虫基因的结构和功能。
一、昆虫细胞质粒DNA提取
实验材料:
- 1.5ml细菌培养物
- 100 μl溶液I(50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA pH 8.0,25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)
- 200 μl溶液II(0.2 mol/L NaOH,1%SDS)
- 150 μl溶液III(60 ml 5 mol/L乙酸钾,11.5 ml 冰乙酸,28.5 ml H2O)
- 70%乙醇
- ddH2O
- 0.5μl RNase
-质粒提取试剂盒
步骤:
1. 取1.5ml细菌培养物,4000rpm离心1分钟,弃上清液,使细菌沉淀尽量干燥。
2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 μl溶液I中,剧烈振荡。
3. 加入200 μl溶液II,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,使溶液II与细菌完全混合,置于冰浴中。
4. 加入150 μl溶液III,盖紧管口,反复颠倒数次,使溶液III在细菌裂解物中均匀分散,置于冰上3-5分钟。
5. 在最大转速下离心5分钟,取上清液于另一个新的管中。
6. 用两倍体积的乙醇沉淀DNA,振荡混合,室温放置2分钟,最大转速离心5分钟。
7. 小心吸去上清液,倒置于滤纸上,使所有液体都流出。
8. 加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,振荡混合,用12000g离心2分钟,弃上清液,放置于室温使乙醇挥发,直至EP管内没有可见液体存在(5-10分钟)。
9. 用0.5μl的RNase在37℃温育5-10分钟。
10. 使用电泳仪设备进行琼脂糖电泳鉴定。
二、昆虫细胞质粒DNA酶切
实验材料:
- 待切样品DNA
- 10×缓冲液
- 限制性内切酶
- ddH2O
步骤:
1. 酶切前确定待切样品的浓度,并选择合适的限制性内切酶和配套缓冲液。
2. 在离心管中加入如下成分:10×缓冲液1μl、待切样品xμl、酶0.5-1μl,加水补足10μl。
3. 混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
4. 将离心管置于37℃中温育1-3小时,若待切样品为PCR产物,则可延长反应时间。
5. 用未酶切的质粒作为对照,进行琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
三、昆虫细胞质粒DNA连接
实验材料:
- 待连接的样品(胶回收产物或PCR产物,载体与片段的mol比为1∶3-5)
- 10×连接缓冲液
- T4连接酶
- ddH2O
步骤:
1. 连接前先使用电泳仪确定待连接载体与片段的浓度。
2. 在离心管中加入如下成分:10×连接缓冲液1μl、待连接的样品xμl、连接酶0.5-1μl,加水补足10μl。
3. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
4. 将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间(根据不同公司的酶的要求而定,一般为22℃1-3小时或16℃连接过夜)。
5. 连接完的样品可直接用于转化,也可放于4℃冰箱短期保存。
通过以上实验步骤,可以实现昆虫细胞质粒DNA的提取、酶切和连接,为后续的PCR扩增等实验。
四、PCR扩增
实验材料:
- 连接完的样品
- PCR反应体系所需试剂(Taq聚合酶、引物、反应缓冲液等)
- ddH2O
-PCR仪
步骤:
1. 准备PCR反应体系,根据实验需要确定反应体系组份和体积,同时设计合适的引物。
2. 在PCR反应管中加入反应体系所需试剂,如Taq聚合酶、引物和反应缓冲液等。
3. 加入连接完的样品,注意控制反应体系中DNA的浓度。
4. 加入适量的ddH2O补足反应体系总体积。
5. 进行PCR扩增反应,根据引物设计的温度条件选择合适的PCR程序。
6. 扩增结束后,取10μl反应产物进行琼脂糖电泳分析,确认PCR扩增结果。
五、DNA回收与纯化
实验材料:
- PCR反应产物
- 天根DNA回收试剂盒(如PCR纯化试剂盒)
步骤:
1. 准备天根DNA回收试剂盒,根据试剂盒说明书中的步骤进行操作。
2. 将PCR反应产物加入DNA回收试剂盒提供的柱子或管子中,进行离心分离。
3. 紧接着,根据试剂盒的要求,采用洗涤缓冲液进行洗涤步骤,去除杂质。
4. 使用洗涤缓冲液洗涤后,将柱子或管子中的DNA进行洗脱,得到纯化后的DNA样品。
5. 使用琼脂糖电泳仪鉴定纯化后的DNA样品的质量和浓度。
通过以上实验步骤,你可以将昆虫细胞质粒DNA经过PCR扩增,然后进行DNA回收与纯化,得到纯净的DNA样品,用于后续的分析、测序等实验。
实验总结:
这个实验步骤详细介绍了昆虫细胞质粒DNA的提取、酶切、连接、PCR扩增以及DNA回收与纯化的过程。这些步骤需要仔细操作,以确保提取的DNA质量和纯度。此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切和PCR扩增。在实验过程中,注意控制反应条件,如时间、温度和试剂浓度,以确保实验结果的准确性。然后使用天能琼脂糖电泳进行分析,以确认提取的DNA的质量和浓度。
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