活细胞成像是指主要用于捕获活体、活动状态的细胞图像的技术，无论是作为单独的静态图片还是作为延时系列。相应地，活细胞成像的技术应用大致可以分为两类：

1.细胞在自然、存活状态下的图像记录

2.实时观察和记录细胞、组织或整个生物体的动态过程

活细胞成像的用途 

采用活细胞成像的研究一直在上升，这主要是由于部分在荧光标记技术，电子数据处理和光学技术的进步。

1960 年代初期绿色荧光蛋白的发现以及自 1990 年代以来其许多衍生物的广泛使用标志着显微镜新时代的开始。荧光蛋白的使用，无论是单独使用还是在产生融合版本的荧光团之后，都可以监测细胞和细胞成分，同时可用的蛋白质和酶靶标的数量不断增加。

事实证明，在细胞生物学和使用细胞生物学技术的领域向前迈出的非常重要的一步是在细胞的存活状态下可视化细胞的能力。活细胞与非活细胞的区别不仅与生命过程中发生的变化有关，也与死亡过程中发生的变化有关。生命是结构的涌现属性，生命过程的停止总是与结构的某些变化有关，无论因果顺序如何。也就是说，无论生命的终止是特定结构变化的结果，还是变化是终止的结果，变化总是存在的。

普通的电子显微镜虽然有着较高的分辨率但却无法可视化活细胞动态。而活细胞成像技术可以有效地记录细胞、组织或整个生物体中发生的动态过程。比如细胞成像仪可以清晰地拍摄到细胞分裂过程以及细胞器的运动和转化，被 标记特定细胞器的荧光标记物以及光谱行为的变化也能在细胞成像仪下被记录。

活细胞成像的重要考虑因素

在使用活细胞成像时，研究人员必须始终牢记，要使该技术取得成功并产生尽可能准确地反映活细胞状态的可用结果，需要满足许多条件。细胞。这些包括：

正确的培养条件。与任何其他组织培养一样，活细胞成像需要使用适当的细胞培养基（包括缓冲液和生长血清）、适当的培养容器和无菌技术。温度必须恒定在 37°C。此外，为了抵消代谢产物引起的酸化并保持 pH 值 7.4，使用了碳酸氢盐 (HCO 3 – ) 和溶解的二氧化碳 (CO 2 )的缓冲系统，并将适当的调节器提供的气体连接到显微镜培养箱. 如果没有 CO 2如果可用，也可以使用含有 10–20 mM HEPES 的缓冲液。培养基中的酚红是监测 pH 值的常用方法。培养容器的选择也很重要。细胞通常在塑料上生长得更好，但玻璃在高倍率下可提供更高的光学质量。另一方面，玻璃通常需要用诸如聚 -L-赖氨酸或聚-L-鸟氨酸之类的基材涂覆。细菌污染始终是一个问题，因此几乎总是使用抗生素。如果特定方案要求避免使用抗生素，则培养物的制备和维护过程中的护理变得更加重要。

保护细胞免受光毒性。由于光毒性，使用荧光成像可能对细胞稳态产生潜在的有害影响，光毒性可能来自不同的来源。细胞内的有机分子如卟啉、黄素等能吸收光，与氧反应降解，释放出超氧自由基、羟基自由基、过氧化氢等活性氧，对细胞造成损伤。荧光染料本身也会产生自由基，因为它们在处于激发态时会与氧气发生反应。可以通过实施一些简单但有效的措施来避免光毒性。这包括 (1) 使用具有较低能量（较长波长）激发光谱的荧光团，(2) 使用尽可能低的光强度和尽可能短的激发持续时间，

适当的帧率。在观察不断变化的事件时，调查员需要确保图像帧速率适合跟踪这些事件。太低的帧速率意味着时间分辨率的损失和记录文件中感兴趣的过程的较差表示。另一方面，过高的帧速率会增加光毒性的风险并导致生成更大的文件。但是，如果要记录的事件的速度如此之高以至于所需的帧速率导致光毒性怎么办？在这种情况下，必须降低激发光强度—— 但这会导致图像变暗。可以增加相机的增益以补偿低光，但这意味着噪声水平也会增加，从而降低图像的质量和准确性。增加相机灵敏度，为了在较低的激发光强度和较低的增益下使用所需的帧速率获得令人满意的结果，在这种情况下比较有帮助的。

高速显微镜仪器的重要性

活细胞成像用于记录各种事件，并且在制作延时序列时，帧速率必须适当。例如，在记录细胞分裂时，事件可能在几分钟内发生，如在一些果蝇胚胎中，或在 24 小时内发生，如在快速分裂的哺乳动物细胞中。当然，有些细胞需要更长的时间才能分裂，但这些与我们无关。在所有这些例子中，低帧率 ——每几秒甚至每几分钟一次——就足够了。在光谱的另一端，有非常快的事件，例如与细胞通讯相关的事件（即动作电位触发和细胞内钙信号事件）。使用适当的时间分辨率可以精确计时现象及其在多细胞神经元网络中发生的级联事件中的位置。电生理 膜片钳等技术可以在细胞水平上实现非常高的分辨率，但在观察网络时用途有限，因为只能同时监测少数细胞。此外，它们的侵入性可能会损害观察中的现象。使用成像方法时不存在这些缺点。

有不同的方法可以通过不同的设置实现快速成像。共聚焦显微镜可以实现相对较高的帧速率，共振扫描仪可以达到几十赫兹，但代价是空间分辨率。旋转圆盘共焦系统可以实现更高的帧速率，在几百赫兹的水平上，同时也会牺牲一些空间分辨率，主要是在 Z 轴上。

当需要较大时间分辨率时，就要选用宽场显微镜。灵敏度是高速显微镜相机最重要的特性，因为高灵敏度相机将能够在困难条件下以较大帧的速率运行，同时仍能提供令人满意的结果。高速相机的核心是传感器， CMOS类型的传感器可以获得较大的灵敏度。

总而言之，活细胞成像具有广泛的应用，但也向研究人员提出了一组特殊的要求，这些要求在对固定细胞进行成像时是不存在的。

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