HeLa细胞全基因组CRISPR筛选对病原侵染机制研究

研究背景

·  艰难梭菌感染（CDI）是发达国家医院内和社区获得性腹泻及胃肠道炎相关死亡的主要原因之一，每年在美国导致约50万例病例和1.5万例死亡。

·  近年来，由于超级毒力菌株的出现和广泛传播，CDI的全球负担有所加剧。艰难梭菌产生三种致病性相关的外毒素：毒素A（ TcdA ）、毒素B（TcdB）和艰难梭菌转移酶（CDT）。

·  在这三种毒素中，TcdB在引起胃肠道疾病中起着关键作用。TcdB是艰难梭菌的主要毒性因子，分为至少8个自然变种/亚型，其中1-4型与人类疾病相关。

·   第二群（clade 2）艰难梭菌，也称为超级毒力群，仅表达两种TcdB变种（TcdB2和TcdB4），这些变种不识别经典的Frizzled（FZD）受体。目前还不清楚这些TcdB变种如何靶向肠上皮细胞引发组织损伤。

研究思路

CRISPR/Cas9筛选： 研究人员使用CRISPR/Cas9筛选技术在全基因组范围内寻找TcdB4的受体。通过筛选，他们发现组织因子途径抑制物（TFPI ）是TcdB4的受体。

结构生物学研究： 为了深入了解TcdB4与TFPI的结合机制，研究人员使用冷冻电镜技术确定了TcdB4与TFPI复合物的结构，并发现了一个对TcdB来说共同的受体结合区域。

功能验证： 为了验证TFPI在体内是否是TcdB4的受体，研究人员使用了TFPI敲除的小鼠模型，并在小鼠结肠环扎模型中测试了TFPI对TcdB4介导的肠道损伤的保护作用。

策略的探索： 最后，研究人员探索了同时抑制TFPI和CSPG4两种受体结合位点的方法，以提供合适的TcdB保护效果。

研究结论

1. 通过细胞病变细胞圆润化测定实现TcdB的毒素对不同类型的细胞的影响，HeLa细胞敏感性最低（最抗病），选择HeLa细胞中进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选。

• 细胞病变细胞圆润化测定 (cytopathic cell-rounding assays)：一种实验方法，用来检测毒素等物质对细胞的影响，通常是通过观察细胞形态变化（如变圆）来评估细胞毒性。
• CR50：指引起50%细胞圆润化的毒素浓度，50%为标准   衡量不同细胞系在病毒侵染筛选下的细胞敏感性.

• 在HeLa细胞中进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选，GeCKO v2向导RNA ( gRNA )文库并进行3轮TcdB4选择

2. NGS进行解码对识别的基因进行排序和绘图，标记出至少靶向三个gRNA的富集基因前30个。

3. 使用CRISPR-Cas9方法生成了TFPI-，PIGX-，PIGM-，和PIGP的KO HeLa细胞进行病毒侵染筛选，获得敏感性基因TFPI，表明细胞表面蛋白TFPI也是TcdB2的受体，但是传统FZD1受体不是TcdB2的受体。

• 细胞表面蛋白TFPI（组织因子途径抑制物）： 是一种在人体内参与血液凝固调控的蛋白质。它主要存在于细胞膜上和细胞外空间 ，TFPI（组织因子途径抑制物）的不同形式，可能与毒素进入细胞的过程相关。

• CSPG4、FZD1-2-7、TFPI： 这些都是细胞表面的蛋白质，与细胞对TcdB4的敏感性有关。

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4. TcdB4对HeLa细胞的毒性机制通过和细胞表面结合发挥作用，膜蛋白TFPI和CSPG4正向调控，TFPI作用尤为明显。

（图2C）磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）的预处理减轻了TcdB4在HeLa细胞中引起的细胞病变;

（图2D） RAC1 糖基化免疫印迹进一步证实了TFPI/细胞敏感性的增加（图2D）。

（图2E）免疫印迹法监测了HeLa WT、FZD1/2/7/，CSPG4/，和TFPI/敲除细胞中TcdB4的表面结合。TcdB4同样结合于WT和FZD1/2/7/细胞的细胞表面。在CSPG4/细胞中，TcdB4的结合略有减少，而在TFPI/细胞中则显著减少

• PI-PLC： 磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（Phosphatidylinositol-specific Phospholipase C），是一种影响细胞信号传导的酶，，能够切割磷脂分子并释放GPI-锚定的蛋白质。

• RAC1糖基化：指的是RAC1蛋白质的一种翻译后修饰，这里用作评估毒素作用的一个指标。

5. TFPIa和TFPIb蛋白互作机制：

6. TFPIK1+K2（效应子）加量后可以使TcdB4侵染HeLa CSPG4/使细胞血红蛋白运输加快 ，且受 细胞膜表面CSPG4正向调控。

A.TFPIK1+K2-Fc、TFPIK1-Fc和TFPIK2-Fc的亚基结构示意图

B.TFPIK1+K2保护HeLa CSPG4-敲除细胞免受TcdB4的影响，但不保护TcdB1（血红细胞运输变慢感病）

C 系统发育分析显示，TFPIK2的一级序列与TFPIK1的亲缘关系最为密切，相似性67.9%

• TFPIa在介导TcdB4的细胞进入方面具有二元效应，由于TFPIa和TFPIb都可以介导TcdB4的结合-进入，推测TcdB4与TFPI的K1和K2结构域（TFPIK1+K2）相互作用。

  
  

7. TcdB4中L1599、K1435、L1434、V1492、L1494、M1438和D1468的点突变取消了TFPI结合能力，表明这些位置对受体识别很重要（TcdB4毒力因子识别位点）。