感受态细胞也能diy ?

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感受态细胞是分子蛋白生物学实验中常用的一种菌株。常见的感受态有：用于蓝白斑筛选鉴别的DH5a；用于表达毒性或非毒性蛋白的BL21菌株；用于 DNA及质粒克隆的TOP10菌株等。但是你知道吗？其实感受态细胞也能DIY ，小编就带领大家了解一下吧，动手能力强的小伙伴也可以试试噢。

一、化学感受态细胞的制备原理

化学感受态细胞基本上是经过化学处理的细菌，使细菌能够在情况需要时，吸收外源质粒 DNA。当大肠杆菌的细胞膜被激活使质粒可以轻松 进入细胞内部，这种吸收外源DNA的状态称为能力，化学感受态细胞主要是通过热休克 进行转化。

上图中我们看出：

图A中的细胞膜完整，外源DNA无法渗透；

图B中的细胞通过处理，细胞膜通透性，外源DNA可以渗透；

 

要制备具有化学感受态细胞，需要培养一批大肠杆菌并进行继代培养。然后，在大肠杆菌生长的对数增长进行收集，成为制备感受态细胞的原材料。因此，在对数生长期收集细胞至关重要。

整个实验过程中，由于是不添加抗生素的，所以我们需要注意无菌操作，谨防感染。细胞收获后，含有 15 % v/v甘油 ，浓度为 100 mM的 CaCl 2缓冲液进行处理，使膜对质粒 DNA 具有半渗透性。

完成之后，将细胞分装出来，置于在 -80 °C下冷冻即可。冷冻时注意加入定量的甘油成分，防止冻伤细胞。

二、制备前的准备：

1.在 LB 肉汤中生长的大肠杆菌菌株的新鲜过夜培养物。

2.进口的无菌离心管。

3.用于读取大肠杆菌光密度的光谱仪。

4.含有 15 % v/v 甘油的 CaCl 2，浓度为 100 mM 。。

5.可耐-80°C以下环境的离心管或冻存管。

三、感受态细胞DIY实验步骤

1.接种目的大肠杆菌菌株在 10 mL 的无菌 LB培养基中。于 37°C 下培养过夜，以 200 rpm 的速度摇晃。

2.将 1 mL 的过夜培养物重新接种到 99 mL 的无菌 LB 中，并在 37°C 下以 200 rpm 的速度摇动，直到达到 600 nm （OD 600）的光密度为 0.3 – 0.5（对数中期）。

3.将 100 mL 培养物平均分配在无菌离心管之间，并在 4 °C 下以 ~ 7000 rpm 离心 10 分钟收集细胞。丢弃上清液并使用瑞宁移液器去除残留的任何液滴。

4.将 20 mL ， 100 mM的无菌 CaCl 2溶液  添加到细胞中，并轻轻地重新悬浮细胞。

5.在 4°C 下以  7000 rpm 左右的冷冻离心机离心 10 分钟左右，收集洗涤过的细胞并丢弃上清液。

6.加入 5 mL ，100 mM 的无菌CaCl 2，并辅以 15% v/v 甘油，然后轻轻地摇匀，使其重新悬浮。

7.用耐冻的离心管进行分装，每管的分装量以50 μL aliquits为宜。

8.将制备好的化学感受态细胞储存在-80°C环境中。效期约为1 年。

实验中的注意事项：

在进行感受态制备的过程中需要注意以下几点：

由于具有化学活性的细胞失去细胞膜屏障，比较脆弱，所以在对大肠杆菌进行处理时需要轻柔对待。

由于培养物中不含抗生素，所以无菌操作很重要，尤其在进行细胞的OD 600检查时。

在为整个实验室组制备感受态细胞时，需要进行分装登记并做好标识，置于-80以下环境中保存。

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