抗体-药物偶联物（ADC）由于其结构和功能的复杂性而存在独特的分析挑战，动态体内生物转化途径需要复杂的生物分析方法。 ADC 的主体是抗体，所以ADC的药代动力学与未偶联的单克隆抗体有许多相似的地方，例如半衰期长、清除率低等。然而，偶联小分子药物导致ADC异质性增加，因此不仅需要通过 ELISA 实现精准定量，还需借助电泳分离、发光检测等技术验证ADC完整性与偶联效率——这一过程中，可靠的实验设备是确保分析结果准确性的关键支撑。
本文以Trastuzumab-MMAE（曲妥珠单抗-MMAE，HER2 靶向 ADC）为例，系统比较ADC药代动力学评估的通用与特异性检测方法，详细阐述方法开发、验证流程及实验室仪器设备的 应用场景，为ADC 定量分析提供 “方法+ 设备 ” 的完整解决方案。
实验材料和方法
1. 总抗体生物分析测定
我们开发并评价了用于定量Trastuzumab-MMAE总抗体的三种ELISA方法，核心依赖荧光酶标仪 实现吸光度精准读取：
① 通用夹心ELISA法：抗人IgG 多克隆抗体同时捕获和检测抗体）；
② 通用夹心ELISA法：捕获抗体为抗人IgG 单克隆抗体，检测抗体为抗人 IgG多克隆抗体；
③ 间接ELISA法：捕获试剂为人HER2 ，检测抗体为抗人 IgG抗体。
图1. 开发并评估定量分析Trastuzumab-MMAE总抗体的三种方法
（图注：包含TMB、抗人IgG抗体、 Trastuzumab-MMAE ADC、 HER2等关键组分的作用示意）
2. 结合抗体的特异性ELISA
针对Trastuzumab-MMAE偶联抗体的定量，除ELISA核心流程外，需通过Western Blot+化学发光成像 验证偶联效率，具体方法如下：
① 特异性夹心ELISA法：抗MMAE 抗体为捕获抗体，生物素化 HER2结合ADC和 HRP-SA 为检测抗体；
② 特异性间接ELISA法：抗MMAE 抗体为捕获抗体，抗人 IgG单克隆抗体为检测抗体；
③ 辅助验证：采用SDS-PAGE分离Trastuzumab 与 Trastuzumab-MMAE，通过化学发光成像确认偶联后蛋白分子量变化，排除未偶联抗体干扰。
图2. 开发并评估两种方法定量Trastuzumab-MMAE特异性抗体
（图注：原文图示，展示抗MMAE抗体作为捕获试剂，与Trastuzumab-MMAE ADC的结合及后续检测流程）
3. 实验试剂与设备
表1. 主要试剂
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Materials |
Catalog No. |
Vendor |
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Affinity Purified Antibody to Human IgG (Fc) |
5210-0165 |
KPL |
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Trastuzumab-MMAE |
HY-164992 |
MCE |
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Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific |
109-035-098 |
Jackson |
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Monoclonal Anti-Human-IgG-Fc Antibody (Mouse IgG1) |
IGG-S307 |
ACROBiosystems |
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Human HER2 (His Tag) |
HE2-H5225 |
ACROBiosystems |
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Biotinylated Human HER2 (His, Avitag) |
HE2-H82E2 |
ACROBiosystems |
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Costar 1×8 Stripwell (high binding) |
42592 |
Corning |
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TMB |
A600954 |
BBI Life sciences |
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BSA |
NA |
Yancheng Saibao |
表2. ELISA所用试剂
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Conditions |
Description |
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Coating Buffer（包被缓冲液） |
15 mmol/L Na₂CO₃, 35 mmol/L NaHCO₃, 7.7 mmol/L NaN₃, pH9.6 |
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Washing Buffer（洗涤缓冲液） |
0.05% Tween-20 in TBS, pH7.4 |
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Blocking Buffer（封闭液） |
2% BSA in Washing Buffer, pH7.4 |
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Sample Dilution Buffer（样本稀释液） |
0.5% BSA in Washing Buffer, pH7.4 |
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Antibody Dilution Buffer（抗体稀释液） |
0.5% BSA in Washing Buffer, pH7.4 |
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Substrate Solution（底物溶液） |
8 μl 3% H₂O₂ + 100 μl 10 mg/mL TMB in 10 mL Substrate Solution A (50 mmol/L NaHPO₄·12H₂O, 25 mmol/L Citric acid, pH5.5) |
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Stop Solution（终止液） |
1 mol/L sulfuric acid |
表3. 核心实验设备（来自天能，适配ADC分析全流程）
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设备名称 |
型号 |
用途 |
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荧光酶标仪 |
天能 Feyond-F100 |
ELISA实验中450 nm波长吸光度（OD₄₅₀）读取，支持空白对照扣除与数据自动计算 |
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微型垂直电泳槽 |
天能 VE-180 |
SDS-PAGE实验中Trastuzumab/MMAE偶联蛋白的垂直电泳分离，适配小样本量（10-20 μL/孔），分离效率高 |
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多功能小号水平电泳槽 |
天能 HE-90 |
用于Western Blot转膜前的凝胶平衡，或核酸电泳辅助验证，兼容多种凝胶尺寸 |
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化学发光凝胶成像仪 |
天能 Tanon 4800 |
Western Blot化学发光信号检测，精准捕捉HRP-TMB反应的发光信号，验证ADC偶联效率 |
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全自动发光成像系统 |
天能 Tanon Chemi Dog 5200T |
高通量化学发光成像，支持多通道检测与定量分析，可批量验证不同批次ADC的偶联一致性 |
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全自动凝胶成像系统 |
天能 Tanon 4100 |
PAGE胶紫外成像，用于电泳后凝胶质量检查（如蛋白条带完整性、无拖尾），确保后续实验可靠性 |
4. 实验流程
4.1 ELISA定量流程
1.
包被：用包被缓冲液稀释蛋白（抗人IgG/HER2），加入酶标板（42592 ，Corning ），4℃孵育过夜（ 16 h ）；
2.
洗涤：每孔加300 μL洗涤缓冲液洗4 次，彻底去除残留液，倒置酶标板干燥；
3.
封闭：每孔加300 μL封闭缓冲液，37℃ 孵育1 h ；
4.
洗涤：重复步骤2；
5.
加样：100 μL梯度稀释的Trastuzumab-MMAE 样本（样本稀释液稀释），37℃ 孵育1 h；
6.
洗涤：重复步骤2；
7.
加检测抗体：100 μL HRP标记抗体（抗体稀释液稀释），37℃ 孵育1 h ；
8.
洗涤：重复步骤2；
9.
加底物：200 μL底物溶液，37℃ 避光孵育20 min ；
10.
终止反应：每孔加50 μL 1 mol/L硫酸；
11.
吸光度读取：使用天能Feyond-F100荧光酶标仪 ，在450 nm波长下读取 OD值，自动计算 “ 最终OD值 = 样本 OD₄₅₀- 空白孔OD₄₅₀”。
4.2 ADC偶联效率验证流程
1.
蛋白样品制备：取Trastuzumab（裸抗）与Trastuzumab-MMAE （偶联物）各 20 μg，加入5×SDS上样缓冲液， 95℃变性5 min ；
2.
电泳分离：将样品加入天能VE-180垂直电泳槽 的凝胶孔中，设置电压（浓缩胶80 V，分离胶 120 V），电泳 60-90 min 至溴酚蓝到达凝胶底部；
3.
转膜与孵育：将凝胶转移至PVDF膜，封闭后加入抗人IgG-Fc 抗体（1:5000 稀释），4℃孵育过夜，再加入 HRP二抗（1:10000 稀释）， 37℃ 孵育1 h；
4.
化学发光检测：膜上滴加ECL底物，放入天能Tanon 4800化学发光凝胶成像仪 ，曝光1-5
min ，观察条带：Trastuzumab-MMAE条带分子量150 kDa ），确认偶联成功；
5.
凝胶质量检查：电泳后的PAGE胶放入天能Tanon 4100全自动凝胶成像系统 ，紫外灯下观察条带完整性，无拖尾则说明分离合格。
1. 总抗体检测结果
三种ELISA方法在测试浓度范围内均表现出优异线性（R²>0.99），裸抗与 Trastuzumab-MMAE 的检测灵敏度相当，说明药物偶联未影响抗体识别。通过天能Feyond-F100荧光酶标仪 的精准读数，方法① （双抗人 Fc多克隆抗体法）的批间精密度（ CV<15%）与回收率（90%-110% ）最优，确立为总抗体定量的首选方法。
2. 偶联抗体检测与设备辅助验证结果
两种特异性ELISA方法均表现出稳定性能（R²>0.99， CV<15%），不同抗 MMAE抗体克隆株（M1H09/M1G04 ）无显著差异（图5 A-B）。通过天能VE-180电泳槽+Tanon 4800成像仪 的辅助验证，Western Blot结果显示：Trastuzumab-MMAE条带分子量较裸抗增加约 5-10 kDa （ MMAE偶联导致），且无未偶联裸抗条带，说明 ELISA 检测的偶联抗体均为有效偶联产物，排除假阳性干扰。
本研究通过“ELISA定量+电泳 / 成像验证”的组合策略，实现了Trastuzumab-MMAE 总抗体与偶联抗体的精准分析，其中适配的实验设备 为实验可靠性提供了关键支撑：
•
天能Feyond-F100荧光酶标仪确保ELISA吸光度读取的准确性，减少空白干扰与人为误差；
•
天能VE-180/HE-90电泳槽实现ADC蛋白的高效分离，为偶联效率验证奠定基础；
•
天能Tanon 4800/Chemi Dog 5200T成像系统精准捕捉化学发光信号，直观验证ADC
偶联完整性。
在ADC药代动力学分析的实际应用中，建议结合“方法选择 +实验室仪器设备适配 ” 双重维度：先选择双抗人Fc 多克隆抗体 ELISA法（总抗体）与抗 MMAE 夹心 ELISA 法（偶联抗体），同时搭配天能电泳
-成像设备组合进行辅助验证，确保分析结果的准确性与可重复性。
此外，Tanon Chemi Dog ULTRA全自动发光成像系统、Tanon 1600凝胶成像仪可兼容不同实验规模（从小样本验证到高通量筛选），为 ADC 的全开发周期提供稳定的技术支持。
