苏州阿尔法生物实验器材有限公司

常见问答
细胞遗传学实验方案-淋巴细胞微核测定方法
来源: 苏州阿尔法生物 时间:2021-12-29

淋巴细胞微核测定是细胞遗传学分析中常用的方法之一,通过微核率的高低可以有效判断染色体畸变率与辐射损伤。 

一、淋巴细胞分离 

    分离使用Ficoll-Paque密度梯度分离淋巴细胞。将血液用磷酸盐缓冲盐水按 1:1 稀释,并在 Ficoll-Paque 上分层,血液 + PBS: Ficoll 的比例保持为 4:3。血液在室温下以 1800 rpm 离心 35 分钟。去除淋巴细胞层(血沉棕黄层)并在 PBS 中以 1200 rpm 洗涤两次,每次 10 分钟,然后用培养基 RPMI 1640 洗涤。用血细胞计数器计数细胞密度。 

二、培养条件

    淋巴细胞在 15 ml 锥形聚苯乙烯离心管中的 5% CO2 加湿培养箱中于 37o 培养。通常,每个培养物由 2 毫升培养基中的 1x10 6 个细胞的初始密度组成。培养基由补充有 10% 胎牛血清 2mM L-谷氨酰胺、100 单位/ml 青霉素、100 ug/ml 链霉素和 1.5% 植物血凝素的 RPMI 1640 组成。

在起始后 44 小时将微核测定细胞松弛素 B 加入到培养物中。细胞松弛素 B 阻止细胞完成胞质分裂,导致多核细胞的形成。细胞培养物中细胞松弛素 B 的最终浓度为 3 mg/ml

    在培养开始后 72 小时,使用细胞离心机 (Shandon, Sewickley, PA) 将淋巴细胞直接离心到载玻片上。然后将细胞以 600 rpm 的速度旋转到载玻片上 10 分钟。在室温下甲醇固定 15 分钟之前,让载玻片风干。载玻片在-20℃ 下储存在密封盒中,在 N2 下干燥。

三、细胞染色与微核测定

染色:将甲醇固定的载玻片在含有 0.1% Tween 20 PBS 中孵育 5 分钟。从载玻片中排出多余的液体,并用含有 0.2% Tween 20 PBS 1:1 稀释 40-50 ul 抗动粒抗体应用% Tween 20。然后将载玻片盖上盖玻片并置于 37oC 的加湿室中 1 小时。在含有 0.1% Tween 20 PBS 中洗涤两次,每次 5 分钟后,再次排出多余的液体,用 1:50 稀释的荧光山羊抗人 IgG覆盖载玻片并再次孵育 1 H。因为荧光标记的抗体暴露在光线下会褪色,此步骤和所有后续步骤应在黄灯下进行。将载玻片在加 0.1% Tween 20 的缓冲液中冲洗两次,并在抗褪色溶液中用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (2 ug/ml) 复染


      对于淋巴细胞微核测试,对 1000 个双核淋巴细胞(那些经历了一次有丝分裂分裂的细胞)进行检测,每个重复培养物中的 500 个细胞,用于计算微核的数量。通过切换到荧光滤光片来确定动粒点的存在与否。

检测标准如下:1) 细胞应具有完整的细胞质的圆形或椭圆形外观

2) 细胞核应同样为圆形或椭圆形,具有完整的核膜

3) 只有经历过一次核分裂的细胞才应检测微核的存在

4) 仅当微核大小为主核的三分之一或以下时才应计数

5) 微核的染色应与主核相似

6) 微核应与主核明显分开。

复制指数 (RI),细胞分裂动力学的量度,通过计算每个样本 400 个总细胞中含有 123 或更多细胞核的细胞百分比,从对微核进行检测的相同载玻片上进行检测。

复制指数RI 计算如下:

      RI = (1x% 单核细胞) + (2x% 双核细胞) + (3x% tri) + (4x% 四核细胞)……

 苏州阿尔法生物十三年专注于生命科学领域实验室设备及实验室耗材和试剂供应领域,包括振荡培养箱、生物反应器、移液器、离心机、显微镜等,集实验室设计规划、 实验室仪器设备、生物实验器材供应、售后服务为一体,使您的实验室采购更加方便快捷。更多淋巴细胞微核 测定相关问题, 0512-62956104  18934597460.