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实时荧光pcr检测DNA浓度常用的生物试剂
来源: 时间:2022-09-15

实时荧光pcr检测利用荧光分析法用特定结合DNA的染料来测定DNA的浓度。常用的DNA染料包括 溴化乙锭、Hoechst33258、SYBR Green I 和 II、SYBR Gold 及 PicoGreen。

溴化乙锭

溴化乙锭含有三环菲嚏平面环系统,可嵌入到双链DNA碱基之间。嵌入DNA双螺旋 后,溴化乙锭的菲嚏环平面位于与螺旋轴相垂直的位置,并通过范德瓦耳斯力与上下碱基 结合。而其平面环系统被埋在底部,其外侧的苯基和乙烷基处于DNA双螺旋的大沟内。 在高强度离子溶液的饱和状态,大约每2.5个碱基对嵌入一分子的溴化乙锭,这与DNA的 碱基组成无关。溴化乙锭的嵌入一般不会对碱基对的构象及其在螺旋中的位置产生影响, 除了会使碱基对沿螺旋轴移位3.4A (Waring 1965)。这种移位可造成饱和溴化乙锭的DNA 分子长度增加 27% (Freifelderl971)。

溴化乙锭还可以高度可变计量学与RNA和热变性或单链DNA形成的链间碱基对结合 (Waring 1965, 1966; Lepecq and Paoletti 1967)»溴化乙锭平面基团的固定位置及其与碱 基的密切接近可使结合的染料散发的荧光比游离在溶液中的染料要强20-25倍O 254nm的 紫外线(UV)照射由DNA吸收,并转移至溴化乙锭;302nm和366nm的紫外线照射由溴 化乙锭本身吸收。在590nm和可见光的红-黄区一小部分(约0.3)可被重新释放出来(Lepecq and Paoletti 1967 ; Tuma et al. 1999)»

大多数销售的UV光源可发射302nm的UV光。溴化乙锭-DNA复合物在此波长产生 的荧光明显强于366nm,但略微低于较短的波长(254nm)。然而,DNA分子的光漂白和 断裂作用在302nm要比在254nm处低得多(Brunk and Simpson 1977)。

溴化乙锭主要用于检测琼脂糖中的DNA (Aaij and Borst 1972; Sharp et al. 1973),但 这种染料也还可以用于半定量地估算DNA溶液的浓度(见方案17)。

▲在酵母及沙门氏菌中,溴化乙锭本身并不容易诱发突变,但它通过微粒体酶代谢的化合物可中度诱变(Mchlerand Bastos 1974; McCann et al. 1975; MacGregor and Johnson 1977; Singer et al. 1999)O  多数研究所开发了安全操作及处理含有 溴化乙锭溶液及胶的说明。研究者应该根据这些说明来处理溴化乙锭。安全处理溴化乙锭的试剂盒也可通过Schleicher & Schuell和Qbiogene 公司及其他渠道获得。

Hoechst 33258

Hoechst 33258是一类双-苯并咪哩荧光染料,可高特异性非插入地结合于DNA双链的 小沟。结合的染料产生的荧光从0.01 ±升到0.6 (Latt and Wohlleb 1975),因此,Hoechst 33258用于双链DNA溶液的荧光检测及定量。Hoechst 33258比溴化乙锭更优先使用,因 为它具有非常强的区分双链DNA与RNA及单链DNA的能力(Loontiens et al. 1990)。

与其他非嵌入染料类似(MUller and Gautier 1975), Hoechst 33258可优先结合DNA螺 旋中的富含A/TK(Weisblum and Haenssler 1974),并随着A+T含量的增加,荧光强度以 10的对数增长(Daxhelet et al. 1989)= Hoechst 33258与双链DNA结合产生的荧光比与单 链DNA结合要强3倍左右(Hilwig and Gropp 1975)。

SYBR Green I

SYBR Green I (Life Technologies)是一种嵌入型青蓝色染料,在488nm蓝色光照射激 发后,在522nm (绿光)具有发射高峰。尽管SYBR Green I可加入到凝胶上样缓冲液中, 但并不推荐这样使用,因为该染料对DNA在凝胶中的迁移影响很大。为得到好的效果, 凝胶应该进行预染处理。由于产生的荧光很强,SYBR Green I是一种可用于检测少量DNA

(低拷贝/PCR产物数量少)的理想染料。少至20pg的DNA或250pg多分散性DNA在经 过SYBR Green I染色后,凝胶可用基于CCD的图像记录系统进行检测。

因为SYBR染料-DNA复合物在非极性溶液中可解离,因此可用乙醇沉淀的方法将 SYBR Green I 从 DNA 中去除。

SYBR Green II

SYBR Green II (Life Technologies)主要用于对电泳后的RNA和单链DNA进行染色。 由于该染料在结合RNA后发出非常亮的荧光及其在凝胶中的低背景,SYBR Green II经常 用来对多聚甲醛/琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中的RNA进行染色。

利用肝脏提取物进行Ames实验显示SYBR染料与溴化乙锭相比致癌性要低(Singer et aL 1999)。但SYBR Green在暴露于UV的细菌中比溴化乙锭更容易诱发突变(Ohta et al. 2001 )o Life Technologies公司现在销售更安全的SYBR染料(SYBR-Safe DNA凝胶染色) (见 Martineau et al. 2008)。

SYBR Gold

SYBR Gold (Life Technologies)是检测凝胶中DNA和RNA高度灵敏的染料,与300nm 紫外光源和基于CCD的图像记录系统联合使用。结合DNA后,SYBR Gold在495nm和 300nm处均有大激发(发射波长可达537nm)。

结合核酸后,SYBR Gold的荧光增强程度是溴化乙锭的30多倍。SYBR Gold染凝胶 中DNA的灵敏度是SYBR Green I的10多倍,染乙醛酸化的RNA的灵敏度是溴化乙锭的 25倍以上。

SYBR Glod也可用于检测甲基敏感的单链构象分析(MS-SSCA) (McKee and Thomson 2004)0然而,由于其成本较高,SYBR Gold并不是检测凝胶中DNA或DNA定量的常规 选择染料。Ames实验显示SYBR Gold并不具有诱变作用(Kirsanov et al. 2010),并且不像 其他菲嚏类染料如溴化乙锭,SYBR Gold可很容易地通过乙醇沉淀法从DNA中去除。

PicoGreen

PicoGreen (Life Technologies)是一种耐光性染料,在480nm处有*大激发,在520nm 处有发射高峰,可特异结合双链DNA。在检测溶液中双链DNA时,其具有高灵敏度和 大动力性范围。PicoGreen广泛应用于多孔板DNA样品的自动化检测和定量。利用一个 染料浓度,可检测1〜1000ng/mL的DNA样品,并可通过手持型荧光分析仪进行精确定量 (见方案19)。

将染料从DNA中去除

在推荐使用浓度范围内,SYBRGreen I和SYBR Gold并不显著抑制限制酶、连接酶及 热稳定DNA聚合酶的活性。这些染料不像溴化乙锭和其他菲嚏类染料,可非常容易通过 乙醇沉淀法从DNA中去除。

溴化乙锭染DNA后可抑制后续酶促反应中DNA作为模板或底物的能力。幸运的是, 溴化乙锭可通过两次等体积的异丙醇或酚:氯仿(25 : 1)萃取,非常容易并快速地从DNA 中去除。去染色的DNA可再通过乙醇沉淀回收。

实际上,所有用于纯化DNA的商业试剂盒或系统都可有效地将溴化乙锭及其他DNA 结合染料从DNA中去除。

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