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浅谈定量PCR实验中的Ct值与Cq 值
来源: 苏州阿尔法生物 时间:2021-12-07

标签:荧光分析法 荧光强度 荧光检测 阈值  定量pcr  pcr  ct值 荧光定量pcr

 在进行定量PCR实验时,实验数据中的C t值是至关重要的。今天将带您了解 Ct值在 qPCR 中的关键作用、及其计算方式和分析统计方法。

 C t多重名称

在我们深入解释什么是 Ct 值之前,我们想花点时间强调一下,多年来该值已被赋予多个名称,包括:

C t – 阈值循环

C p – 交叉点

TOP——起飞点

C q – 量化周期

这些值都是一样的,只是名称不同。为了规范qPCR的命名法,一般标准实验中会使用Cq值。

PCR

什么是 C q值?

定量PCR实验通常用于量化目标序列的绝对量或比较样本之间目标序列的相对量。该技术通过放大过程中发出的目标特异性荧光信号实时监测目标的扩增。

尽管实时荧光定量PCR中, 荧光染料和探针 应该是序列特异性的,但在大多数实时 PCR 实验中会出现大量的背景荧光。通过阈值线和 C t值可以轻松分析背景中的荧光信号,了解 PCR的循环周期。其实,所谓的阈值线是检测水平或反应达到高于背景水平的荧光强度的点。在进行 PCR 之前,您(或您的 PCR 仪中的软件)设置了一个阈值水平。这实际上是图表中的一条线,代表高于背景荧光的水平,它也在指数阶段开始时与反应曲线相交(图 1)。

C q值是您的样品反应曲线与阈值线相交处的 PCR 循环数。该值表明从您的样本中检测到真实信号需要多少个周期。实时 PCR 运行将具有每个样品的反应曲线,因此会有许多 C q 值。您的 PCR 仪软件会计算 每个样品的 Cq值并绘制图表。

qpcr

(实时 PCR 扩增曲线上的阈值水平和 C q 值)

C q 值与样本中目标核酸的数量成反比,并与样本中的目标拷贝数相关。较低的 C q值(通常低于 29 个循环)表示大量的目标序列。较高的 C q 值(超过 38 个循环)意味着较低的目标核酸量。高 C q值也可能表明目标或 PCR 设置存在问题,如本文后面的陷阱部分所述。

您的 PCR 仪器将在每个循环中收集荧光数据。大约 15 个循环后,您将对背景荧光水平有一个很好的了解 ——这将显示为一条从零循环点开始的直线。阈值水平将刚好高于此水平,但在您的样品开始进入 PCR 扩增指数阶段时。今天,计算机软件可以计算出这个确切的点,所有现代实时循环仪都有一个自动阈值线设置。

实时 PCR 记录反应过程中发出的荧光量,此时所有 PCR 成分都非常丰富。这样,C q  值通常在实时 PCR 中的重复之间保持一致。当达到 PCR 反应终点时,积累的抑制剂、失活的聚合酶和限制性试剂会在终点值上产生很多变化,这就是传统 PCR 无法定量使用的原因。

影响Cq值的相关因素有哪些?

许多因素会影响您的 C q 值。 您的样品之间C q 值的一些差异将是由于生物事件,例如您的目标基因响应治疗而上调/下调。然而,C q 值同样容易受到 PCR 反应准备和 PCR 组分本身的影响。比较常见的是以下几种情况:

1. 主混音

溶液中的 pH 值和盐浓度会影响荧光发射。荧光发射的任何变化都会自然地改变您的 C q值。因此,请确保您只使用高质量的 PCR 组件,如果使用自制溶液,请在每次实验前检查 pH 值并监测盐沉淀。

2. 被动参考染料

反应值是您的 FAM(报告基因)染料与您的 ROX(被动参考)染料的荧光比率。假设 FAM 荧光不变,较低量的 ROX 会产生较高的反应值。

3. 反应效率

PCR 反应效率取决于预混液性能、引物的特异性、引物退火温度和样品质量。一般来说,90% 以上的 PCR 效率是可以接受的。100% 的 PCR 效率表明感兴趣的目标序列在每个循环中加倍。完美的 PCR 效率与模板 10 倍稀释之间 3.3 个循环的变化相吻合。

要确定每个引物对的 PCR 效率,请使用五个 10 倍稀释步骤对模板进行系列稀释,并计算 R 2 ,这是一种描述一个值预测另一个值的统计量度。对于接近 100% 的 PCR 效率,您的 R 2 值应大于 0.99。

对标准曲线上的每个点至少运行三个重复。对于低拷贝数输入,更高的重复数尤其重要,因为重复数之间的变化更有可能发生。

定量PCR

4. 其他问题

假设您已经排除了上述 3 个因素,导致 C q 值晚的常见原因可能是:

模板太少 - 尝试使用更多模板。

次优的核酸分离——考虑您的核酸分离方案,量化您的 DNA,运行琼脂糖凝胶,尝试其他方案/ 试剂盒。

cDNA 合成过程中逆转录酶活性较差——逆转录酶对降解敏感。订购一个新的。

RNA/cDNA 降解——保持您的工作空间清洁,改善您的RNA 处理行为 ,避免 cDNA 的多次冻融循环。

PCR抑制。

另外其他原因也同样会影响定量PCR 的Cq值,包括细胞系/培养物中的感染或污染,但这些问题通常在核酸分离之前被发现。

更多PCR相关问题请拨打0512-62956104进行咨询或留言。