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利用脂质体转染试剂进行293T细胞转染实验步骤
来源: 苏州阿尔法生物 时间:2022-06-22

 LipoGene2000、Lipofectamine 3000脂质体转染试剂是一种常用的阳离子脂质体转染试剂,它可以 有效地将质粒或 siRNA 以及核酸-蛋白质复合物转染到培养的贴壁和悬浮细胞系中。研究人员经常使用 LipoGene/ Lipofectamine 系列转染试剂进行基于 siRNA 和 shRNA 的基因敲除实验以及基因表达研究。293T细胞转染实验步骤如下:

细胞转染实验

1、细胞培养:以293T细胞转染前一天(20-24小时)~0.4×10 6 个细胞(具体细胞数取决于细胞大小和细胞生长速度),接种到六孔板中,使其达到70-90%次日转染时汇合。

2. 在接下来的转染步骤之前更换新鲜的细胞培养基。培养基的体积约为 2 ml。

3. 轻轻混合 Lip脂质体转染试剂。

4. 取无菌离心管,在 250 μl DMEM 溶液中加入 4 μg 质粒,用移液器轻轻混匀。

这里需要注意两点:

a.抗生素、谷氨酰胺等对 LipoGene 转染或Lipofectamine没有影响。如果 Lip转染试剂表现出对靶细胞毒性作用 ,建议从转染系统中去除抗生素。

b.如果有必要,DMEM 可以更换为其他培养基,如 1640、 MEM、F12 等,这对 Lip转染试剂 的转染效率没有影响。质粒的量可在0.1μg ~4μg范围内适当调整,Lip的量通常为4~ 8μl(质粒体积/LipoGene体积=1:1~1:2 )。由于细胞类型、培养条件、转染参数等会极大地影响转染效率,因此需要在推荐范围内优化质粒体积/Lip转染试剂体积。对于其他培养板或培养容器,各试剂用量可参照转染试剂相关说明表进行换算。

5. 取另一个无菌离心管,在 250 μl DMEM 溶液中加入 6 μl LipoGene,用移液管轻轻混匀,室温孵育 5 分钟。

6. 用移液管将步骤 4 中的 DNA 溶液与步骤 5 中的 LipoGene 溶液轻轻混合。这个过程中需要注意不要涡旋或离心。

7. 在室温下孵育 LipoGene-DNA 混合物 20 分钟。可能会出现絮状沉淀,属于正常现象,不会影响转染效率。

8. 将 500 μl LipoGene-DNA 混合物加入六孔板的一个孔中,无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,然后轻轻摇晃并混合成“8”字形。

9. 注意:对于贴壁细胞,如上所述,只需将 LipoGene-DNA 复合物添加到细胞中并孵育 6 小时,然后再更换溶液。如果转染悬浮或半悬浮细胞,建议使用平角离心法,在细胞培养皿中加入适量的 LipoGene-DNA复合物后(步骤8),密封密封膜,放入平角离心机,低速 (200 g) 离心 1.5 小时,然后放入培养箱中 6 小时,然后更换培养基。

10. 培养6-12小时后,用完全培养基更换培养基,继续培养。

转染试剂参数

  这里需要注意的是:当与细胞一起孵育 6 小时时,Lip试剂转染后的混合物通常足以产生高转染效率。大多数细胞与 LipGene型转染试剂一起培养长达 72 小时,没有明显的细胞毒性。但是,转染后6小时更换新鲜培养基可以提高一些生长较快的细胞的转染效率。对于一些容易转染的细胞,如HEK-293T细胞,是否更换转染液主要 取决于细胞的生长状态,细胞生长快转染效率就高。

11、细胞转染后的操作:

1)基因表达,24-40小时后可检测转染效率。可以用荧光显微镜观察 GFP 或其他荧光基因的表达。

2)构建稳定细胞株,转染后24小时可加入合适的筛选药物如G418或嘌呤霉素筛选稳定细胞株

293t细胞转染实验步骤 中的注意事项:

1. 使用高的纯度 DNA (A260/A280=1.8) 有助于获得较高的转染效率。对于质粒,建议使用 Qiagen 或天根的质粒提取试剂盒进行高质量且无内毒素的提取。

2、细胞的生长状态会对细胞的转染效率造成较大影响,所以转染前细胞要处于良好的生长状态。

3.转染试剂盒中一般是不带DMEM培养基,需要自行配备。其他培养基如 1640、MEM、α-MEM 、F12、DMEM/F12 和 M199 也是可以 可用于转染实验的。

4. LipoGene 或Lipofectamine脂质体转染试剂不能涡旋或离心。当该试剂放置较长时间时,只需轻轻摇晃并混合即可。

5. 试剂长时间暴露在空气中,也有可能会降低转染效率。

6、出于健康和安全的考虑,需要在符合洁净度要求的细胞培养室进行转染,并穿戴实验室外套和一次性手套、口罩和无菌帽。

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文章标签:脂质体 试剂 细胞转染 细胞培养