苏州阿尔法生物实验器材有限公司

常见问答
基于细胞粘附的细胞分离技术
来源: 阿尔法试剂 时间:2022-04-14

基于细胞粘附的细胞分离技术的简介

大多数细胞分离程序之前都是尽可能多地去除无关材料,尤其是当新鲜分离的组织是起始材料时。下面列举了一些常见的过程。

· 实体组织的消化/分解——需要首先将整个组织的碎片分解成单细胞悬浮液。表 2 总结了常用方法试剂盒可用, Miltenyi Biotec的神经和肿瘤组织分离试剂盒。Thermo Fisher / Gibco 的胶原酶和 TrypLE 是受欢迎的选择 。在消化/分解过程中可能会引入实验伪影,例如,释放酶会引入转录伪影 ,酶消化会激活小胶质细胞。

· 从血液中分离血浆——血浆是血液中含有凝血因子、白蛋白、盐、矿物质等的液体部分,可能会干扰细胞检测。因此,血沉棕黄层通常比全血更受欢迎:后者收集在涂有抗凝剂的试管中,然后以 200 xg 的速度离心并关闭刹车。将富含 WBC 的带或夹在上血浆和下 RBC 层之间的血沉棕黄层仔细吸出。

· 去除死细胞和碎片——原代细胞和培养细胞通常需要清理死细胞和碎片,以确保下游步骤顺利进行。200-300 xg 的低速离心、重力沉降和尼龙网筛是实现这一目标的一些简单方法。也可以使用特定的试剂盒,例如死细胞去除试剂盒

类型

例子

组织

机械均化

声波处理、手动粉碎、高速混合

软组织

酶消化

胶原酶、蛋白酶 K、嗜热菌蛋白酶

软组织和软骨组织

酸消化

盐酸

骨和纤维组织


2。组织崩解的常用方法。

基于细胞粘附的细胞分离技术

细胞的粘附特性

根据细胞是否需要附着在固体表面上才能生存和生长,可以分为以下几类:

· 粘附 - 这些细胞需要合适的表面才能生长,例如巨噬细胞、成纤维细胞、间充质干细胞等。这种附着是通过细胞表面上的细胞粘附分子 (CAM) 与培养物上的相应配体之间的相互作用发生的表面。在体外细胞粘附方面重要的 CAM 家族是整合素家族,它可以附着在胶原蛋白、纤连蛋白和其他细胞外基质蛋白上。

· 悬浮细胞——这些细胞自然不需要附着表面,而是悬浮在体内,通常在血液和淋巴液等液体中。例子包括淋巴细胞、粒细胞和其他免疫细胞。这些细胞的体外生长和选择也发生在悬浮液中。胚胎干细胞和成体干细胞也不需要锚定,可以在无血清培养基中悬浮生长。

· 失去接触抑制和锚定依赖性的癌细胞。在没有任何锚定设施的无血清条件下,癌细胞可以形成球体和无定形聚集体。

细胞培养容器的粘附特性

自从哺乳动物细胞培养成为生物医学研究和诊断的主要内容以来,培养容器的制造——特别是聚合物表面——也经历了重大改进。直到 1950 年代,只有 Pyrex® 玻璃烧瓶和培养皿可用,这严重限制了原代细胞的培养范围(因为后者不附着在玻璃表面),并且还产生了额外的维护和灭菌费用。第一个一次性塑料培养容器于 1960 年代问世,由聚苯乙烯制成,具有光学透明度、延展性和易于消毒的特性。然而,简单的聚苯乙烯由于其疏水性而无法解决细胞不粘附的问题。该溶液用于处理聚苯乙烯表面,使其更具亲水性。实现这一目标的主要方法有以下三种:

· 氧化——成型后不久,聚苯乙烯表面用化学氧化剂或电离辐射处理,产生氧化离子并接枝到聚苯乙烯链中。这种处理使带负电荷的血清蛋白结合的聚苯乙烯表面带正电,由此产生的血清扩散为细胞附着提供了更好的表面。已经测试了各种氧化剂,例如臭氧、、氢氧化钾、盐酸、紫外线辐射等。如今,采用的方法是在大气压下暴露于电晕放电或在真空下暴露于气体等离子体。

· 蛋白质涂层——氧化聚苯乙烯的局限性在于它只能支持细胞在含有血清的培养基中生长。为了支持需要无血清条件的贴壁培养系统,需要一种可以附着在细胞上特定粘附受体上的蛋白质涂层。用于涂层的常见细胞外基质蛋白有胶原蛋白、纤连蛋白、软骨素等 。

· 用聚赖氨酸包被——聚赖氨酸是一种阳离子聚合物,它为细胞膜的带负电荷的离子提供一个带正电荷的培养表面。使用聚赖氨酸的优点是它与所有贴壁细胞类型非特异性相互作用,因此聚赖氨酸涂层板可用于不同的细胞类型和培养物 。

用细胞培养技术的说法,所有上述类型的板都被称为组织/细胞培养处理。相反,一些细胞需要悬浮培养以进行特殊培养,例如胚状体或肿瘤球体的形成。超低附着板可用于此类应用 - 这些表面涂有亲水性凝胶,可中和任何表面电荷并防止细胞粘附并使它们保持悬浮。


细胞分离

通过粘附特性分离细胞

根据细胞的贴壁依赖性,细胞培养系统大致分为贴壁式和悬浮式。通过添加必要的生长因子和合适的细胞培养板,可以根据特定的细胞类型对贴壁细胞和自由漂浮细胞的分离进行调整。我们在下面描述三个例子:

· 贴壁培养——例如:巨噬细胞、成纤维细胞、间充质细胞

巨噬细胞通常从骨髓或外周血中分离出来。分离单核细胞后,可以将它们与血清和单核细胞/巨噬细胞分化细胞因子混合物一起接种在包被的聚苯乙烯板上。5-7 天后,细胞分化并形成单层贴壁,而不需要的细胞仍处于悬浮状态并被丢弃。小胶质细胞、脑巨噬细胞也可以类似地分离出来 。

· 悬浮培养物——例如:干细胞、胚状体、肿瘤球。

在没有血清的情况下,通过在超低附着板中培养,可以将在悬浮液中自然生长的细胞和失去贴壁依赖性的细胞与贴壁细胞分离。所需的细胞要么在单细胞悬浮液中生长,要么聚集形成漂浮的球体。没有附着表面的支持,贴壁细胞就会消失 。例如,Hoffmann M 等人通过去除粘附的成纤维细胞获得了人气道上皮细胞。

基于粘附的隔离的应用、优点和局限性

基于粘附的方法在技术上简单、可重复且大多具有成本效益,可产生良好的细胞作物。限制是回收细胞的纯度很低,并且总是存在与其他细胞以及细菌交叉污染的风险。

具体应用包括

· 血液和骨髓细胞特别是巨噬细胞的常规分离。

· 癌症干细胞(例如结肠球、乳腺球、神经球)的分离和表征有助于识别和扩增稀有的癌症干细胞。

· 从分化的谱系阳性细胞中分离成体干细胞和祖细胞。