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常见问答
活细胞成像的显微成像系统和检测器要求

标签:相机 显微镜 活细胞成像    领域:科技

       在设计用于活细胞成像研究的光学显微镜系统时,主要考虑因素是检测器灵敏度(信噪比)、所需的图像采集速度和样本活力。在使用活细胞时,必须严格避免在记录固定细胞和组织的图像时通常使用的相对较高的光强度和较长的曝光时间(其中光漂白是主要考虑因素)。几乎在所有情况下,活细胞显微镜都代表了实现较佳图像质量和保持细胞健康之间的折衷。

   原则上,理想的活细胞图像采集系统应该足够灵敏,可以从弱荧光标本中采集优质图像,同时足够快以记录所有动态过程。此外,该系统将具有足够的分辨率来捕捉精细的样本细节和能够准确测量微小的强度差异的宽动态范围。但是,如果优化这些标准中的任何一个都是以牺牲其他标准为代价的。因此,目前不可能设计出适合所有可能研究范围的通用活细胞成像系统。反而,研究人员必须通过确定较重要的优化参数来做出妥协,同时仍然试图限制那些被认为不太感兴趣的变量所做出的牺牲。较后,显微镜配置较终取决于成像模式的要求、在实验过程中保持标本活力的必要性、标记协议的难度级别以及设备的可用性。

活细胞成像

活细胞成像技术

活细胞成像是在光学显微镜中使用广泛的对比度增强成像模式进行的。大多数研究涉及某种形式的荧光显微镜,通常与一种或多种透射光技术相结合。比如:荧光技术包括传统的宽场落射荧光、激光扫描共聚焦、旋转盘和扫场共聚焦、多光子、全内反射 ( TIRF )、荧光相关光谱、寿命成像 ( FLIM )、光活化和激光捕获。作为一个子集,它包含:光谱成像、多色成像、共定位、延时序列、光漂白恢复技术(FRAP、FLIP和FLAP)、共振能量转移 ( FRET )、散斑显微镜 ( FSM ) 和膜片钳通常与一种或多种主要成像模式耦合。荧光技术可以辅以传统的明场模式,包括微分干涉对比 ( DIC )、霍夫曼调制对比 ( HMC)) 和相位对比,作为荧光探针定位的确认。在几乎所有情况下,每种显微镜配置都需要一些独特的考虑因素,这些因素必须实施才能成功进行活细胞成像。无论采用何种显微镜和数码相机系统对活细胞和组织进行成像,两个较重要和限制因素是维持细胞活力和实现高于背景噪声和自发荧光的可能信号水平。

活细胞成像中的信噪比

      固定细胞成像和活细胞成像之间的根本区是:固定细胞成像为研究人员提供了足够的空间来定义图像采集参数,例如定位合适的视场和确定曝光时间,以及调整电子增益设置、读出率和偏移值。因此,在大多数情况下(使用充分染色的固定标本)可以获得利用相机系统的全动态范围的图像,从而产生较佳的信噪比。由于维持细胞活力的严格要求对成像参数的限制,活细胞的情况会有所不同。对于获得的活细胞图像,样本的强度通常只比背景的强度高几个灰度级。在这种情况下,探测器系统的暗电流和读取噪声水平成为细胞成像所必要考虑的条件。  经济型相机通常具有较高的噪声水平,这样会导致背景图像不太均匀,通常会掩盖来自样本的信号,随着读出速度的提高,这种影响会变得更加严重。所以在几乎所有活细胞成像应用中,检测器的选择对于决定实验的成败至关重要。

其实,数字成像中的四个主要噪声源来自探测器、照明系统、泊松噪声或散粒噪声(由于光子通量的随机性)和杂散光。在大多数情况下,可以通过仔细选择检测器和优化照明条件来系统地降低噪声。几乎每种类型的光子探测器都会在设备记录的每次测量中引入某种形式的噪声。激光扫描和多光子显微镜中使用的光电倍增管可以在信号放大系统内产生杂散电子。

为了克服传统高性能 CCD 相机在需要在极低光照水平下快速捕捉帧速率的应用的缺点,制造商推出了一种创新方法,用于放大 CCD 读取本底噪声以上的微弱信号。通过集成片上倍增增益寄存器,电子倍增器件 ( EMCCD ) 以低得多的成本实现了增强型或电子轰击 CCD 典型的单光子检测灵敏度,并且不会影响传统 CCD 架构的量子效率和分辨率特性。 

活细胞成像对细胞显微镜光学系统的要求

      针对活细胞成像应用的显微镜必须配备由坚固的复合材料或铝制成的高质量框架,并且应该通过牢固地安装在无振动平台上来稳定。外部光学表面以及组件外壳(聚光镜、灯箱、物镜转盘等)应保持清洁状态,显微镜周围的环境应无尘且相对湿度较低。活细胞成像持续需要的常规程序之一是使用科勒照明原理确保显微镜光学路径和光阑对齐。

     活细胞成像较关键的方面可能是实现较佳放大倍率,同时在实验过程中平衡信号强度(有利于低倍率)、分辨率(有利于更高倍率)和细胞活力。研究人员使用时注意用尽可能少的透镜元件将光学放大倍率与探测器的像素大小相匹配。具有多种中间放大倍数的光耦合器可在市场上买到,以满足光限制和高分辨率应用的特定物镜要求(放大倍率和数值孔径)。在选择显微镜物镜放大倍率时,应严格考虑奈奎斯特分辨率标准。

显微镜物镜选择

      活细胞成像常用的标准显微镜物镜是 10x 和 40x(干),以及 40x、60x 和 100x 油浸或水浸版本。经济的干式低倍率镜头主要用于样品的初步扫描以定位感兴趣的区域,并且不需要高光学校正因子。而浸没透镜应具有高数值孔径(油为 1.3 至 1.45,水为 1.2)和高透光效率。由于图像通常聚集在视场中心附近,因此高度校正以产生平坦视场的物镜通常不会提供可检测的好处,并且与校正较少的物镜相比,成本明显更高且光效更低。

           冷却单色 sCMOS 和 CCD 相机是大多数涉及培养中活细胞的成像应用的适宜选择,无论是落射荧光还是具有对比度增强(DIC 和相差)的透射光是主要采集模式。在选择相机时,要考虑的重要参数包括量子效率、噪声水平(暗电流和读数)、像素大小(以及相关的全阱容量)和扫描频率。为了尽量减少撞击样品的激发光水平,相机应尽可能灵敏,这通常意味着高量子效率、低噪声、大像素尺寸和慢扫描速率。

显微镜成像技术

      慢扫描 CCD 相机的帧速率通常受到限制,除非样品具有极亮的荧光,否则当曝光时间短时信噪比会差。这限制了这些相机系统在高速成像应用中的使用(范围高达每秒 30 帧),并阻碍了对样本进行聚焦的尝试。在定位合适的标本和聚焦相机时,应尽量避免光漂白和光毒性,这些伪影会影响细胞活力和亮度。在这方面,应选择具有无快门、帧传输的EMCCD装置 或行间 CCD 传感器的相机,这些传感器除了能够提供慢速扫描数字信号外,还能够以视频速率提供连续的图像流。

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