脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒

脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒规格：

质检标准 pH：7.2~7.4 

内毒素含量：＜10 EU/mL 

生物安全：细菌、真菌、支原体检测阴性 

质量检测：诱导测试合格

| 检验原理 

阿利辛蓝广泛用于酸性多糖的染色，如软骨 或组织中的糖胺聚糖和细胞分泌的外被多糖的 染色等。干细胞在诱导培养基的作用下，会逐渐 向软骨细胞方向分化。软骨细胞外具有一层富含 蛋白多糖的基质，是成软骨分化的标志物，可被 阿利辛蓝染成蓝绿色。

 成软骨诱导分化操作（平面诱导） 

1. 细胞分化诱导 

将对数生长期的细胞消化下来计数，成软骨 诱导分化培养基诱导液重悬细胞，离心后调整细 胞密度密度1.0~2.0×10e7cells/mL。 吸取20 μL细胞悬液（约2.0~4.0×10e5个细胞） 悬滴至24孔板中央。置于37℃，5% CO2培养环境 下培养2~3 h使细胞贴壁。 2~3 h后补充1 mL成软骨诱导分化培养基诱 导液正常培养。每隔2~3天换液一次。按照以上 换液频率诱导21~28天，并注意观察细胞形态变 化。 

2. 染色鉴定 

2.1 细胞固定 吸去培养基使用适量 1×PBS 清洗一次，弃去 后取适量 4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室 温固定 30~60 min 后，弃去固定液再使用 1×PBS 清洗两次。

 2.2 阿利辛蓝染色 向清洗干净的诱导孔内加入适量染色液，避 光静置染色 30 min。 吸去阿利辛蓝染色液，用 1×PBS 清洗两次， 并加入适量 1×PBS 避免细胞干燥。

 2.3 诱导评估 显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像 采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内 酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。

 1. 干细胞的准备 

将对数生长期的细胞消化下来计数，取 3×10e5 个细胞转移到 15 mL 离心管中，250 g 离 心 4 min。 弃上清，加入 0.5 mL 成软骨诱导分化培养基 预混液，重悬细胞，150 g 离心 5 min。小心弃去 上清，加入 0.5 mL 成软骨诱导分化培养基诱导 液，重悬细胞，150 g 离心 5 min。 将 15 mL 离心管的管盖稍稍旋开，放置于 37℃，5% CO2培养环境下培养。

 2. 细胞分化诱导 

24 h 后观察细胞沉淀形变团聚的情况，如有 明显的变化，则小心轻柔地拨动管底，尝试让细 胞团脱离管底，全部浸润在诱导液中。 置于 37℃，5% CO2培养环境下培养约 21 天， 通常每 2 天更换一次新鲜配制的成软骨诱导分化 培养基诱导液。注意观察细胞团成球情况及表面 光滑度，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色 鉴定。

 3. 染色鉴定 

3.1 软骨球固定 将软骨球从离心管中转移至 EP 管，并使用 1 ×PBS 清洗两次，最后置于适量的 4%中性甲醛溶 液中。

 3.2 石蜡包埋切片 软骨球经石蜡包埋后切片。 

3.3 阿利辛蓝染色 将石蜡切片脱蜡和脱水，使用阿利辛蓝染色 液染色 30 min，用自来水冲洗 2 min，蒸馏水冲 洗 1 次。 

3.4 诱导评估 显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像 采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内 酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。 

NOTE: 干细胞的成软骨分化水平因细胞类型、细胞供体 来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。