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酶联免疫吸附试验-ELSIA的种类和应用
来源: 苏州阿尔法生物实验器材官网 时间:2023-01-29
酶联免疫吸附测定 (ELISA) 被称为免疫测定金标准。是一种免疫学测定方法,这种测试一般较为灵敏,通常用于检测和量化物质,包括抗体、抗原、蛋白质、糖蛋白和激素。酶联免疫吸附试验也常用于诊断 HIV 感染、妊娠试验和血型鉴定等。

碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是ELISA中很少使用的酶。

ELISA 在原理上类似于放射免疫测定 (RIA),但更安全且成本较低。

ELISA 有助于抗原或抗体的定性(存在或不存在)和定量(浓度)测量。

当前使用的酶联免疫分析技术主要有以下几种:

1.直接ELISA

直接和间接 ELISA 都从将抗原包被到 ELISA 板上开始。

步骤:

  使用直接 ELISA 的优势主要是消除二抗交叉反应,并且由于步骤更少,与间接 ELISA 相比速度更快。它的缺点包括与其他类型的 ELISA 相比灵敏度低,反应成本高。

elisa-method-elisa试剂盒

2. 间接 ELISA

    间接 ELISA 的步骤与直接 ELISA 相同,除了额外的洗涤步骤和去除缓冲液后添加的抗体类型。间接 ELISA 需要两种抗体,一种是粘附在目的蛋白上的检测一抗,另一种是与一抗互补的酶联二抗。

    开始需要加入一抗,然后进行洗涤步骤,再加入酶联二抗并孵育。此后,步骤与直接 ELISA 相同,包括洗涤步骤、添加底物和检测颜色变化。

简要步骤如下:

       间接 ELISA法也常用于检测血清中是否存在抗 HIV 抗体。与直接 ELISA 相比,间接 ELISA 具有较高的灵敏度,反应成本较低,这种类型的 ELISA 的主要缺点是二级检测抗体之间存在交叉反应的风险。 

3.  酶联免疫吸附试验-夹心式elisa

与直接和间接 ELISA 不同,夹心 ELISA 从包被到板孔上的捕获抗体开始。因为抗原夹在两层抗体(捕获抗体和检测抗体)之间,所以也称为“三明治”。

   流程如下:将捕获抗体添加到板中后,将板盖上并在 4°C 下孵育过夜。包被步骤完成后,用 PBS 清洗板,然后用 BSA缓冲/封闭。缓冲液洗涤在室温下进行至少 1-2 小时。末了,在加入抗原之前用PBS再次洗涤板。

   然后将目标抗原添加到板中以与捕获抗体结合并在 37 摄氏度下孵育 90 分钟。重新清洗板,然后将检测一抗添加到板中并再孵育 1 至 2 小时在室温下,然后用缓冲液清洗。然后加入酶联二抗,再孵育 1 至 2 小时。重新清洗板,加入底物以产生颜色变化。夹心 ELISA 在所有 ELISA 类型中具有具有较高的灵敏度。夹心式elisa 的主要缺点是会耗费较多的时间和费用,另外这种ELISA 方法,必须要使用配对的抗原(二价/多价抗原)和二抗。

简略步骤如下:

4. 酶联免疫吸附试验-竞争性 ELISA

  竞争性 ELISA方法主要用于检测血清中是否具有特异性的抗原/抗体。这种类型的 ELISA 会使用两种特异性抗体,一种酶联抗体和另一种存在于测试血清中的抗体(如果血清呈阳性)。将两种抗体结合到孔中将允许竞争结合抗原。颜色变化的存在意味着测试是阴性的,因为酶结合抗体结合了抗原(而不是测试血清的抗体)。没有颜色表明测试呈阳性,并且测试血清中存在抗体。

     该技术中,需要将抗体与溶液形式的抗原(在样品中)一起孵育,然后将该混合物添加到抗原包被的微量滴定孔中。样品中存在的抗原越多,可用于结合抗原包被孔的游离抗体就越少。添加对一抗同种型具有特异性的酶偶联二抗 (Ab2) ,用于确定与孔结合的一抗数量,如在间接 ELISA 中一样。

    竞争性 ELISA 特异性低,不能用于稀释样品。然而,好处是需要的样品纯化较少,它可以测量给定样品中的大范围抗原,可用于小抗原。然而,需要注意的是在该技术中,原始样品中抗原的浓度越高,吸光度越低。 

ELISA-酶联免疫检测试剂盒

 酶联免疫吸附试验 ELISA的应用:

1.检测和测量给定样品中的抗原或抗体。(自身抗体:抗 dsDNA、抗 dsg1、ANA 等;传染病抗体:抗菌、抗病毒、抗真菌;甲型、乙型、丙型肝炎、艾滋病毒等)

2.检测和估计肿瘤标志物的水平:比如:前列腺特异性抗原 (PSA)、癌胚抗原 (CEA)

 影响酶联免疫吸附试验ELISA结果的因素有哪些?

主要包括检测板、包被缓冲液、捕获抗体、封闭缓冲液、靶抗原、检测抗体、酶偶联物、洗涤液、底物、信号检测的质量和完整性都会干扰正确的 ELISA 测试。一些可能干扰测试的因素如下:

1.微孔板:孔的形状和质量、板的材料、潜在的预激活、均匀或不均匀的涂层

2.缓冲液:pH、污染

3.捕获和检测抗体:孵育时间、温度、特异性、滴度、亲和力

4.封闭缓冲液:交叉反应、浓度、污染

5.靶抗原:构象、稳定性、表位

6.酶结合物:类型、浓度、功能、交叉反应

7.清洗:污染、频率、体积、持续时间、成分

8.基板:微孔板的质量、材质

9.检测:检测相关的仪器设备:比如:分光光度计、读板机等相关因素

10. 误差:人为误差(实验步骤不规范等)

     苏州阿尔法生物提供了荧光显微镜、纳米粒度分析仪、紫外分光光度计、酶标仪、读板仪等实验室仪器设备广泛用酶联免疫吸附试验、抗原检测、外泌体研究等。另外我们还提供细胞培养摇床、电泳仪、ELISA试剂盒、96孔板、细胞培养摇瓶等,更多实验室仪器和 生物实验器材耗材需求,可以0512-62956104或18934597460进行了解。