酶联免疫吸附测定 (ELISA) 被称为免疫测定金标准。是一种免疫学测定方法，这种测试一般较为灵敏，通常用于检测和量化物质，包括抗体、抗原、蛋白质、糖蛋白和激素。酶联免疫吸附试验也常用于诊断 HIV 感染、妊娠试验和血型鉴定等。

碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是ELISA中很少使用的酶。

ELISA 在原理上类似于放射免疫测定 (RIA)，但更安全且成本较低。

ELISA 有助于抗原或抗体的定性（存在或不存在）和定量（浓度）测量。

当前使用的酶联免疫分析技术主要有以下几种：

1.直接ELISA

直接和间接 ELISA 都从将抗原包被到 ELISA 板上开始。

步骤：

•   将抗原添加到板中，在 37 摄氏度下孵育一小时或在 4 摄氏度下孵育过夜。
•   孵育步骤完成后，下一步是清洗任何潜在未结合抗体的板，并使用 BSA、卵清蛋白、抑肽酶或其他动物蛋白等试剂封闭 ELISA 板上任何未结合的位点。
•   这一步很重要，因为它可以防止任何非特异性抗体与板结合，并尽可能地减少假阳性结果。添加缓冲液后，重新洗涤板，并添加选定的 酶联检测一抗 。将板进一步温育一小时。
•   在直接 ELISA 中，主要检测抗体直接与感兴趣的蛋白质结合。
•   接下来，重新洗涤板以去除任何未结合的抗体，然后向板中添加底物/发色团，例如碱性磷酸酶 (AP) 或辣根过氧化物酶 (HRP)，从而导致颜色变化。样品的颜色变化是通过 AP 从底物中水解磷酸基团或通过 HRP 氧化底物而发生的。

  使用直接 ELISA 的优势主要是消除二抗交叉反应，并且由于步骤更少，与间接 ELISA 相比速度更快。它的缺点包括与其他类型的 ELISA 相比灵敏度低，反应成本高。

2. 间接 ELISA

    间接 ELISA 的步骤与直接 ELISA 相同，除了额外的洗涤步骤和去除缓冲液后添加的抗体类型。间接 ELISA 需要两种抗体，一种是粘附在目的蛋白上的检测一抗，另一种是与一抗互补的酶联二抗。

    开始需要加入一抗，然后进行洗涤步骤，再加入酶联二抗并孵育。此后，步骤与直接 ELISA 相同，包括洗涤步骤、添加底物和检测颜色变化。

简要步骤如下：

• 将含有一抗 (Ab1) 的样品添加到抗原包被的微量滴定孔中，然后附着在孔中的抗原与 Ab1 发生反应。
• 未结合或游离的 Ab1 都被洗掉，酶标二级抗体 (Ab2) 被添加到微量滴定孔中。
• 与酶偶联的二抗与一抗结合。
• 游离或未结合的 Ab2 都被洗掉，并添加酶的特定底物。
• 形成的有色反应产物的量的测定主要由紫外分光光度计、酶标仪、微孔板读板机等仪器来完成。

       间接 ELISA法也常用于检测血清中是否存在抗 HIV 抗体。与直接 ELISA 相比，间接 ELISA 具有较高的灵敏度，反应成本较低，这种类型的 ELISA 的主要缺点是二级检测抗体之间存在交叉反应的风险。 

3.  酶联免疫吸附试验-夹心式elisa

与直接和间接 ELISA 不同，夹心 ELISA 从包被到板孔上的捕获抗体开始。因为抗原夹在两层抗体（捕获抗体和检测抗体）之间，所以也称为“三明治”。

   流程如下：将捕获抗体添加到板中后，将板盖上并在 4°C 下孵育过夜。包被步骤完成后，用 PBS 清洗板，然后用 BSA缓冲/封闭。缓冲液洗涤在室温下进行至少 1-2 小时。末了，在加入抗原之前用PBS再次洗涤板。

   然后将目标抗原添加到板中以与捕获抗体结合并在 37 摄氏度下孵育 90 分钟。重新清洗板，然后将检测一抗添加到板中并再孵育 1 至 2 小时在室温下，然后用缓冲液清洗。然后加入酶联二抗，再孵育 1 至 2 小时。重新清洗板，加入底物以产生颜色变化。夹心 ELISA 在所有 ELISA 类型中具有具有较高的灵敏度。夹心式elisa 的主要缺点是会耗费较多的时间和费用，另外这种ELISA 方法，必须要使用配对的抗原（二价/多价抗原）和二抗。

简略步骤如下：

• 使用夹心式elisa，抗体被固定在微量滴定孔中，而不是抗原。
• 添加含有待检测或测量的抗原的样品并使其与固定化抗体反应。
• 清洗孔并加入对抗原上不同表位具有特异性的第二种酶联抗体，并使其与结合的抗原反应。
• 通过洗涤去除任何游离的二抗后，加入酶特异性底物。
• 这称为夹心 ELISA，因为待检测的抗原夹在两种抗体（结合抗体和酶联抗体）之间。
• 末了，通过分光光度计、酶标仪等实验室仪器使用分光光度法来测定有色反应产物。

4. 酶联免疫吸附试验-竞争性 ELISA

  竞争性 ELISA方法主要用于检测血清中是否具有特异性的抗原/抗体。这种类型的 ELISA 会使用两种特异性抗体，一种酶联抗体和另一种存在于测试血清中的抗体（如果血清呈阳性）。将两种抗体结合到孔中将允许竞争结合抗原。颜色变化的存在意味着测试是阴性的，因为酶结合抗体结合了抗原（而不是测试血清的抗体）。没有颜色表明测试呈阳性，并且测试血清中存在抗体。

     该技术中，需要将抗体与溶液形式的抗原（在样品中）一起孵育，然后将该混合物添加到抗原包被的微量滴定孔中。样品中存在的抗原越多，可用于结合抗原包被孔的游离抗体就越少。添加对一抗同种型具有特异性的酶偶联二抗 (Ab2) ，用于确定与孔结合的一抗数量，如在间接 ELISA 中一样。

    竞争性 ELISA 特异性低，不能用于稀释样品。然而，好处是需要的样品纯化较少，它可以测量给定样品中的大范围抗原，可用于小抗原。然而，需要注意的是在该技术中，原始样品中抗原的浓度越高，吸光度越低。 

 酶联免疫吸附试验 ELISA的应用：

1.检测和测量给定样品中的抗原或抗体。（自身抗体：抗 dsDNA、抗 dsg1、ANA 等；传染病抗体：抗菌、抗病毒、抗真菌；甲型、乙型、丙型肝炎、艾滋病毒等）

2.检测和估计肿瘤标志物的水平：比如：前列腺特异性抗原 (PSA)、癌胚抗原 (CEA)

• 检测食品样品中的潜在过敏原。
• 用于某些类别药物的快速推定筛选。
• 肽、抗体、激素、蛋白质等物质的检测和定量
• 外泌体检测、细胞外囊泡检测等

 影响酶联免疫吸附试验ELISA结果的因素有哪些？

主要包括检测板、包被缓冲液、捕获抗体、封闭缓冲液、靶抗原、检测抗体、酶偶联物、洗涤液、底物、信号检测的质量和完整性都会干扰正确的 ELISA 测试。一些可能干扰测试的因素如下：

1.微孔板：孔的形状和质量、板的材料、潜在的预激活、均匀或不均匀的涂层

2.缓冲液：pH、污染

3.捕获和检测抗体：孵育时间、温度、特异性、滴度、亲和力

4.封闭缓冲液：交叉反应、浓度、污染

5.靶抗原：构象、稳定性、表位

6.酶结合物：类型、浓度、功能、交叉反应

7.清洗：污染、频率、体积、持续时间、成分

8.基板：微孔板的质量、材质

9.检测：检测相关的仪器设备：比如：分光光度计、读板机等相关因素

10. 误差：人为误差（实验步骤不规范等）

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