文章标签: 缓冲液 dna提取 蛋白质 乙醇 色谱柱 试剂
不了解 DNA提取试剂盒的工作原理？我们在本文中介绍了基础知识，因此您可以完善您的核酸分离并获得高质量的 DNA。
DNA提取是分子生物学实验中必不可少的基础实验步骤。因为我们在分子生物学中所做的几乎所有事情在开始都需要 DNA 或 RNA，无论是 qPCR、分子克隆、下一代测序还是其他任何东西。
如今，大多数实验室都使用商业 DNA 提取试剂盒，这些试剂盒使用硅胶自旋过滤法来获得高质量的 DNA。这些可以快速有效地纯化 DNA（或 RNA）。但这确实意味着很多人只是按照说明操作，并不了解 DNA 提取试剂盒的工作原理。
为什么要了解核酸提取试剂盒的工作原理？
离心柱包含一种硅胶树脂，可根据盐条件和受提取方法影响的其他因素选择性地结合 DNA 和 RNA。这些 DNA 提取试剂盒使整个过程比旧的 DNA 分离方法更容易、更快。但是，使用套件的缺点是，如果您不了解套件的黑匣子中的内容，则会使故障排除变得更加困难。
因此，在本文中，我将详细解释 DNA 提取试剂盒的工作原理以及每一步的操作。
我还将讨论在 DNA 提取中使用硅胶柱的一些常见问题，只要稍微了解一下就可以克服或避免这些问题。
一、
RNA和DNA提取：
裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 还是 RNA 而异，但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。
Chaotropes（离液剂）的作用：Chaotrope会破坏氢键及疏水间的相互作用。离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。
洗涤剂：除了离液剂外，裂解缓冲液中通常还有一些去污剂，以帮助蛋白质溶解和裂解。
溶菌酶和蛋白酶K:根据样品类型，也可以使用酶进行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一，实际上在这些变性缓冲液中效果较 好；当蛋白质变性增多，蛋白酶 K 的作用也会相应增强。然而，溶菌酶在变性中不起作用，因此溶菌酶处理通常在添加变性盐之前进行。
二、关于质粒制备的注意事项
分离质粒 DNA 与提取 RNA 或 基因组 DNA 的提取方式是不相同的，因为必须质粒与基因组 DNA 必须分离。如果此刻， 您加入离液剂将立即释放所有物质，并且无法将小环状 DNA 与高分子量染色体区别开来。因此，在质粒制备过程中中，直到裂解后才加入离液剂，盐用于结合。
三、DNA 提取后纯化：将 DNA 与色谱柱结合
离液盐对于裂解至关重要，而且对于将 DNA（或 RNA）与色谱柱结合也是如此。此外，为了增强和影响核酸与二氧化硅的结合，还添加了酒精。
大多数情况下这是乙醇，但有时可能是异丙醇。乙醇百分比和体积有很大的影响。太多，你会带入大量降解的核酸和小物种，这会影响 A260 读数并降低你的一些产量。太少，可能难以从膜上洗掉所有盐分。
如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污剂，请尝试使用NaCl 作为沉淀剂， 以避免去污剂污染 DNA 或 RNA。
四、洗涤 DNA（或 RNA）
当裂解物通过硅胶膜进行离心分离，现在所提取的 DNA 或 RNA 应该与柱子结合，杂质、细胞蛋白和多糖应该已经通过了。
但是，膜仍然被残留的细胞蛋白质和盐弄脏。如果样品来自植物，仍然会有多糖，也许一些色素留在膜上，或者如果样品是血液，膜可能会被染成棕色或黄色。
洗涤步骤用于去除这些杂质。
通常有两次洗涤，尽管这可能因样品类型而异。第一次洗涤通常会含有少量的离液盐，以去除蛋白质和有色污染物。这之后总是用乙醇洗涤以除去盐。
如果开始的准备工作没有大量蛋白质，例如质粒准备或 PCR 清理，则只需要乙醇洗涤。去除离液盐对于获得高产量和高纯度的 DNA 或 RNA 至关重要。一些试剂盒甚至会用乙醇清洗柱子两次。如果残留盐分，核酸的洗脱会很差，A230读数会很高，导致260/230的比率很低。对于无乙醇 DNA 和 RNA，需要进行干法离心，乙醇洗涤后，大多数方案都有一个离心步骤来干燥柱子。这是为了去除乙醇，对于清洁的洗脱液是必不可少的。 当将 10 mM Tris 缓冲液或水应用于膜进行洗脱时，核酸会水合并从膜中释放出来。如果色谱柱上仍有乙醇，则核酸无法完全再水合。如果跳过干燥步骤会导致乙醇污染和低产量。很可能在 Nanodrop 上看不到 乙醇吸光度，所以它不会出现在您的读数中。
五、RNA 和 DNA 提取：洗脱
DNA 提取方案的还剩余的步骤就是从硅胶中释放纯 DNA 或 RNA。
对于使用DNA提取试剂盒进行DNA制备，通常使用 pH 值为 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱碱性 pH 值下更稳定，在缓冲液中溶解得更快。即使对于 DNA 颗粒也是如此。水的 pH 值往往较低，低至 4-5，并且高分子量 DNA 在用于洗脱的短时间内可能无法完全再水合。
通过在离心前让缓冲液在膜中停留几分钟，可以较大限度地洗脱 DNA。
由于RNA 易溶于水，且RNA 利于处在微酸性的 pH 值环境下。
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