蛋白酶体是蛋白质合成过程中错误折叠的蛋白质和其他蛋白质被蛋白酶解的主要降解途径。蛋白酶体抑制剂也被称为蛋白酶抑制剂 是广泛用于癌症的辅助药物。
蛋白酶体存在于所有真核细胞、古细菌和一些细菌中。它是一种多催化蛋白酶，由多种催化和调节蛋白组成。它具有三种或四种不同的肽酶活性，包括胰蛋白酶样、糜蛋白酶样和肽基谷氨酰肽水解活性。大多数蛋白质在蛋白酶体降解之前被泛素化。据估计，大约 20% 的 26S 蛋白酶体在没有蛋白质毒性应激的情况下参与蛋白质降解。
图 1.泛素-蛋白酶体系统的示意图。
蛋白酶抑制剂作为癌症的辅助药物，并在实验室研究中得到广泛应用。Bortezomib，也称为 PS-341、Velcade 和 MG-341，是 经FDA 批准的用于骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的药物。还经常用于实验室实验以抑制蛋白酶体活性。其他几种蛋白酶体抑制剂也正在研究测试，包括双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、盐孢菌胺 A、卡非佐米、ONX 0912、CEP-18770 和 MLN9708等。
常用的蛋白酶体抑制剂的主要特征
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抑制剂 |
机制 |
应用 |
贮存 |
备注 |
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MG132 |
可逆的 |
~10uM，1 小时 |
-20°C |
较便宜，还抑制 NF-kB 激活 (IC50 = 3 uM) 和钙蛋白酶 |
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乳胞素 |
不可逆转 |
~10 微米，2 小时 |
-20°C |
稍贵，还抑制 NF-kB 活化，比 MG132 更具蛋白酶体活性特异性 |
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蛋白酶体抑制剂 I |
可逆的 |
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-20°C |
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表 2。蛋白酶体抑制剂的主要特征、处理浓度、储存、实验室研究
MG132
MG132，也称为carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal，Z-LLL-CHO，是一种肽醛，是一组能够抑制不同类型蛋白酶的化学物质之一，包括丝氨酸蛋白酶、钙蛋白酶等. MG132 和其他肽醛已被证明能强烈抑制蛋白酶体的多种肽酶活性和钙蛋白酶活性 。
MG132蛋白酶抑制剂的应用
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细胞类型 |
备注（处理时间/浓度） |
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A. polyphaga细胞, HEK293 细胞 |
0.1 uM，感染前 1 小时并始终保持 |
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A431 细胞 |
10 微米 |
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拟南芥原生质体 |
1-10 微米，2 小时 |
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COS-7 细胞 |
25 微米，5 小时 |
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COS-7，海拉细胞 |
20 微米，24 小时 |
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H1299、HeLa、U2OS 细胞 |
10 微米，12 小时 |
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海拉细胞 |
20 毫米，24 小时 |
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HEK293 细胞 |
20 微米，3-6 小时 |
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HEK293 细胞 |
1 微米，16 小时 |
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HEK293T细胞 |
50 uM，4 到 7 小时 |
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乳腺上皮细胞 |
10 微米，4 小时 |
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RAW 264.7 单元格 |
50 uM，3 到 6 小时 |
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酵母 |
60 uM ，至少四个小时 |
表 1。上表中表示 MG132 应用（处理时间和浓度）。
蛋白酶体是细胞功能的组成部分。MG132 和其他蛋白质体抑制剂对细胞和组织有毒性，在高浓度或长时间感染后会导致细胞死亡。建议在一定范围内滴定适宜浓度（例如，1000x）。适宜浓度不仅取决于特定的细胞类型，还取决于细胞培养参数，例如细胞汇合度、血清浓度和培养基成分。
MG132 应储存在 -20°C，可溶解在 DMSO (10 mg/ml) 或甲醇 (1 mg/ml) 中，分装并储存在 -20 或 -80°C。如果 MG132 DMSO 溶液在添加到培养基中时产生沉淀，可以将 DMSO 原液加热至 40°C。
图 2. MG132 的化学结构。
乳胞素
Lactacystin 是一种抗生素，从链霉菌中分离出来，现在可以化学合成。它在细胞和体内水解成 clasto-lactacystin beta-lactone，这可能是共价修饰哺乳动物 20S 蛋白酶体中 X 亚基的 N 末端苏氨酸的活性抑制剂。共价结合是特异性的，因此它不会影响半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶，其表现比肽醛（如 MG132）好。
图 3. lactacystin 的化学结构。
Lactacystin 可以在细胞培养中以 10 uM、25 uM 使用数小时。
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细胞类型 |
感染时长及浓度 |
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BxPC-3 |
10 uM, 12, 24, 48 小时 |
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HEK-293T 细胞 |
25 uM，4 到 7 小时；10 微米，10 小时 |
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RAW 264.7 单元格 |
10 微米，2 小时 |
表 2。表格中为 lactacystin 应用示例（处理时间和 lactacystin 浓度）。
lactacystin常用于研究杆菌水肿毒素对核糖原合酶激酶 3beta 的影响，以及研究 LRRK2 泛素化和降解的调节。
蛋白酶体抑制剂 I
蛋白酶体抑制剂 I (PSI)用于孵育转染细胞和 Peptide Institute 蛋白酶体抑制剂 PSI (N-carbobenzoxy-L-isoleucyl-L-gamma-t-butyl-L-glutamyl-L-alanyl-L- leucinal) 用于处理细胞。
Velcade（PS-341、MG-341、硼替佐米）在实验室实验中用于抑制蛋白酶体活性。Velcade 细胞毒性已检测。实验中用 50 uM/L Velcade 处理 8 小时的 HEK-293 细胞没有明显的细胞损失。而使用浓度在 0.5 至 50 μmol/L 的Velcade 长时间孵育（24 小时）导致约 40% 的细胞死亡 。
XAV 939
ADP-核糖基 转移酶tankyrase (TNKS) 对PI31 的ADP-核糖基化抑制PI31 的20S 抑制，从而促进26S 蛋白酶体活性。 XAV939是一种 TNKS 的小分子抑制剂，可阻断 PI31 ADP-核糖基化。
蛋白酶体抑制的验证
使用蛋白酶体抑制的主要目的就是降低蛋白酶体活性的减弱。一般通过以下两种方法进行验证：一是通过Suc-LLVY-AMC（N-succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-7-amido-4-methylcoumarin）作为荧光蛋白酶体活性指示剂。泛素融合降解底物 Ub-G76V-GFP 在蛋白酶体抑制时发出荧光。另一种方法是通过蛋白质印迹检查单泛素和多泛素部分水平之间的比率。如果蛋白酶体活性受到抑制，则应该有较低水平的单泛素。
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