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常见问答
质粒提取浓度低的原因
来源: 苏州阿尔法生物 时间:2022-11-25

使用质粒提取试剂盒进行质粒提取时常常会遇到质粒浓度低,质粒提取效果不理想等问题,那么提取质粒浓度低的原因有哪些呢?

一、细菌离心后,加入溶液蜗旋振荡时,发现菌体呈絮状不易混匀,或成细砂样。

   很可能是细菌发生溶菌,可减少培养时间、降低培养温度试试看,通常降低培养温度 会使细菌生长更加稳定;同时也可以试试平板培养,培养后,用PBS将菌落洗下,再进行质粒的提取,固体培养基上细菌生长的要好一些。

二、加入溶液,菌液浑浊度没有发生明显变化。

    裂解不完全,主要问题是发生在溶液上。确保10%SDS是澄清的,确认NaOH是有效的,如使用的是试剂盒,确认溶液I是澄清没有沉淀的。如确认原因不是发生在溶液II上,而是细菌浓度比较高,可相应增加溶液I/III的体积。此外,还有可能是"杂菌"污染。

三、加入酚仿抽提,离心后在水相和有机相间没有变性蛋白层,但随后的乙醇沉淀发现大量的半透明沉淀,溶解后蛋白浓度高。

   乙醇沉淀时,较纯的质粒沉淀应该是白色(PEG纯化的沉淀是透明的,肉眼不易发现),如沉淀是半透明的凝胶状,则是蛋白含量高。出现此类问题时确认两点

1.平衡酚是否被氧化、pH是否是8.0

2.溶液III/Ⅲ反应后,离心的上清pH是否在8.0左右。有时,由于溶液配置的问题,导致溶液I/IIL反应后离心的上清pH8.0偏差较大,导致平衡酚抽提时没有有效的将蛋白抽提出来,有时,离谱的pH会导致水相和平衡酚互溶。

四、使用酚仿抽提方法,质粒A260/A280的纯度也很好,但酶切不能完全切开。

1.确认酶的有效性;

2.平衡酚是否被氧化而呈现棕色,而非正常的黄色;

3.是否不小心吸入了痕量的酚;

4.乙醇沉淀后,70%乙醇漂洗的是否充分,残留的盐类会影响酶切;

5.乙醇漂洗后是否完全干燥,残留的乙醇会影响酶切;

五、 提取质粒中RNA没有去除。

主要原因是RNase失效,或效率不高。

建议∶1.更换RNase A,并保证其储存条件是正确的;

2. 对于手工提取质粒,可单独增加一步去处RNA的步骤,即溶液反应后,离心的上清中加RNase,室温37度去RNA10min~30min,但需要保证你的RNase A是经过失活DNase的,同时较高温度(如50度)会更加快速完全的去除RNA,但本人经验,经过高温处理的质粒质量也不高。

六、传统手工大提质粒,使用PEG8000纯化的问题。

     A .PEG8000不需要灭菌,当然,你要确认你的PEG8000是分子生物学使用级别(我们一直使用的SIGMA的);

B.如果PEG8000纯化后的得率很低,需要确认一下加入PEG8000前,质粒溶液是否是TE,而不是含有大量其它杂盐得溶液。在PEG8000纯化前,质粒溶液应该是经过乙醇或异丙醇沉淀,且经过70%乙醇漂洗过的;沉淀步骤应在冰上或4度进行。

C. 关于PEG8000处理后离心看不见沉淀的问题∶PEG8000的沉淀是透明的,有时可以看到沉淀,而有时很难辨出沉淀

七、 试剂盒提取质粒也会成为提取质粒浓度低的原因

     检查漂洗液,是否配置太久,而且在使用后没有旋紧盖子。

八、培养基、抗生素、质粒提取都没有问题,而细菌菌液提取不到质粒。

        可以使用细菌质粒提取试剂盒。

九、 原先测序鉴定没有问题的细菌,37度摇菌后发现质粒大小或序列出现异常。————这种情况出现的几率较小。常出现在较大质粒或比较特殊的序列中

决办法

a.降低培养温度,在20~25度下培养,或室温培养可明显减少发生概率;

b.使用一些特殊菌株,如Sure菌株,它缺失了一些重组酶,如rec类等,使得质粒复制更加稳定。

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