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常见问答
细胞外泌体分离方法

标签:外泌体 离心分离 外泌体分离 高速离心机 细胞外泌体

     在生物流体中发现的细胞外囊泡包括来自内体多泡体的细胞外泌体(30 nm 150 nm)和来自质膜的微泡(150 nm 1000 nm)。目前已知有多种从生物体液中分离外泌体的方法出了使用高速离心机离心分离法以外,还有色谱法、超滤过滤法、基于聚合物的沉淀和免疫分离法

       这些细胞外泌体分离方法提取的外泌体要警惕非外泌体颗粒污染,如凋亡小体、凋亡小囊泡、外泌体和脂蛋白,均会对获得的外泌体生物活性产生影响另外,分离方法会影响细胞外泌体的纯度和产量。如果要从培养基中分离外泌体,就要使用无血清培养基或无外泌体胎牛血清

外泌体分离方法优缺点对比:

分离方法

分离机制

分离技术优势

分离方法缺点

差速离心

该方法包括几个离心步骤,旨在去除细胞、大囊泡和碎片并沉淀外泌体。

差速离心是用于从生物体液和培养基中分离外泌体的标准且非常常用的方法。

当使用血浆和血清等粘性生物流体进行分析时,该方法的效率较低。

密度梯度离心

该方法将超速离心与蔗糖或碘克沙醇密度梯度相结合。

该方法允许将低密度外泌体与其他囊泡、颗粒和污染物分离。

对离心时间非常敏感。

尺寸排阻色谱

尺寸排阻色谱法根据大分子的大小分离大分子。它采用填充有多孔聚合物珠的色谱柱。

该方法允许大分子和小分子的精确分离和各种溶液的应用。与离心方法相比,层析分离的外泌体的结构不受剪切力的影响。

该方法需要较长的运行时间,这限制了色谱分离在处理多个生物样品中的应用。

过滤

超滤膜用于将外泌体与蛋白质和其他大分子分离。外泌体群集中在膜上。

过滤允许从外泌体中分离小颗粒和可溶性分子。在此过程中,外泌体群被过滤膜浓缩。

外泌体可以粘附在过滤膜上,并在以下分析中丢失。此外,由于施加了额外的力以使分析的液体通过膜,因此外泌体可能会变形或损坏。

基于聚合物的沉淀

该技术包括将生物流体与含聚合物的沉淀溶液混合、孵育步骤和低速离心。

沉淀的优点包括对分离的外泌体的温和影响和中性 pH 值的使用。

基于聚合物的沉淀方法可共同分离非囊泡污染物,包括脂蛋白。此外,聚合物材料的存在可能与下游分析不兼容。

免疫分离

应用了各种免疫学方法。与特定抗体结合的磁珠用于分离外泌体。此外,还开发了基于 ELISA 的分离方法。

该方法允许分离所有外泌体或外泌体的选择性亚型。此外,它还可用于外泌体蛋白的表征和定量。

该方法不适用于大样本量。此外,分离的囊泡可能会失去功能活性。

筛分分离

筛分分离技术通过膜筛选压力电泳等方法进行过滤来分离外泌体。

相对较短的分离时间并提供高纯度的分离外泌体。

分离的外泌体回收率低。


1。外泌体分离方法比较

差速离心法:

差速离心仍是实验中常用的外泌体分离技术。

主要步骤如下:

1.使用离心机低速离心去除细胞与细胞碎片

2.而后增加转速通过离心来消除样本中较大的细胞囊泡

3.再使用高速离心进行高速离心,通过离心沉淀的方式提取外泌体。

在这里,需要注意的是生物流体的粘度与分离的外泌体的纯度有较强的相关性。

所以,对于高粘度的生物样品需要超速离心机进行较长时间的离心操作。

差速离心法

1.差速离心

密度梯度离心

    这种方法将超速离心机的超速离心与蔗糖密度梯度相结合 。具体地说,密度梯度离心用于将外泌体与非囊泡颗粒(例如蛋白质和蛋白质/RNA 聚集体)分离。因此,该方法将囊泡与不同密度的颗粒分离。足够的离心时间比较重要,否则如果外泌体部分具有相似的密度,则仍可能在外泌体部分中发现污染颗粒。

色谱分析法

2.用于分离外泌体的纤毛多孔结构。该结构不会让大于 1 μm 的细胞和其他颗粒进入布线区域。一些较小的颗粒和细胞碎片可以进入微柱区域,但被纳米纤毛排除,形成直径为 30-200 nm 的孔。纤毛结构选择性地捕获外泌体和小细胞外囊泡

尺寸排阻色谱分离法

      尺寸排阻色谱 (SEC) 用于根据尺寸而非分子量分离大分子。该技术应用了一种填充有多孔聚合物珠子的柱子,该珠子含有多个孔和隧道。分子根据它们的直径穿过珠子。小半径分子通过色谱柱的孔迁移需要更长的时间,而大分子从色谱柱中洗脱得早。尺寸排阻色谱可以精确分离大分子和小分子。此外,该方法可以应用不同的洗脱溶液。与离心机离心方法相比,色谱分离具有较优势,因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响,避免了因剪切力所造成的囊泡结构改变。目前,SEC 是一种广泛接受的分离血液和尿液中存在的外泌体的技术。

    此外,SEC 方法与超滤相结合已用于分离和分析尿源性外泌体。此外,流场-流分馏结合紫外分析仪和光散射检测器已被应用于分析外泌体的大小和纯度。流场-流分馏结合抛物线和交叉流来分离外泌体。获得的外泌体已通过电子显微镜和质谱检测。

过滤

     超滤膜也可用于外泌体分离。根据微泡的大小,使用超滤膜过滤的方法可以将外泌体与蛋白质和其他大分子分离。外泌体也可以通过多孔结构捕获它们来分离(图 2)。常见的过滤膜孔径为 0.8 µm0.45 µm 0.22 µm,可用于收集大于 800 nm400 nm 200 nm 的外泌体。比如微柱多孔硅纤毛结构一般用于分离 40-100 nm 外泌体。在初始步骤中,去除较大的囊泡。在接下来的步骤中,外泌体群集中在过滤膜上。隔离步骤相对较短,但该方法需要用 PBS 缓冲液对硅结构进行预孵育。

除标准过滤技术外,切向流过滤在有效分离外泌体方面也有着尝试应用通过切向流过滤技术去除游离肽和其他小化合物从而分离具有确定大小的外泌体。此外,在体外研究和脂肪组织中,也会采用超滤与 SEC 结合的方式来分离外泌体。

 筛分分离法

3.外泌体过滤的筛分模型。通过 (a) 对片上过滤器施加压力或 (b) 产生电场,迫使外泌体穿过多孔膜,结合错流和电泳分选 [来完成筛分。

基于聚合物的沉淀

     基于聚合物的沉淀技术通常包括将生物流体与含聚合物的沉淀溶液混合、4℃孵育和低速离心。用于基于聚合物的沉淀的常见聚合物之一是聚乙二醇 (PEG)。这种聚合物的沉淀可以对分离的外泌体产生温和影响而且可以产生中性 pH 值。由此,出现了几种常见外泌体试剂盒:比如: System Biosciences, Mountain View, CA,  ExoQuick™ 等。

研究表明,使用 ExoQuick™ 方法可以快速执行,无需额外设备,只需用高速离心机进行超速离心可以获得高产量的外泌体。但是此方法的缺点是:非外泌体材料对外泌体分离物的污染仍然是基于聚合物的分离方法的一个问题。此外,分离物中的聚合物可能会干扰下游分析。

免疫分离法:

 免疫芯片方法基于表面外泌体受体,用于根据来源分离外泌体。获得的外泌体可直接分析或用于 DNA 或总 RNA 分离 。外泌体胞内蛋白可用作分离外泌体的特异性标志物。此外,基于 ELISA ExoTEST™ 也可以用于有效分离外泌体。其原理是:使用涂有外泌体抗体的 ExoTEST™ 板,可以从各种生物体液中分离出外泌体。该方法适用于常见和细胞类型特异性外泌体蛋白的检测、分析和定量。

筛分分离:

 该技术通过膜从生物液体中筛分外泌体并通过压力或电泳进行过滤来分离外泌体 (图 3)。筛分分离法的分离时间较短,但分离的外泌体纯度却处于较的水平。筛分分离的缺点在于分离的外泌体回收率较低。

         总之,细胞外泌体提取、外泌体分离在肿瘤等研究领域发挥着重要作用。细胞外泌体分离方法目前多数还是采用高速离心机 进行离心分离的技术方法,然而,其他几种分离技术,如过滤、免疫分离和筛分虽然也能进行外泌体分离但每种方法都有其局限性,多数还是仅应用于实验室、科学研究等领域。0512-62956104或18934597460