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Wetern Blot-蛋白印迹实验步骤

蛋白免疫印迹法是蛋白质学中常用的检测方法,Wetern Blot-蛋白印迹实验步骤


主要是通过SDS凝胶分离、转印到膜上并进行信号检测的方法。具体实验方法如下:

一、试剂和缓冲液


二、样品制备

样品也可以在一些商业裂解缓冲液中裂解,例如Thermo Fisher的 Pierce IP 裂解缓冲液 ,而不是 RIPA 缓冲液。

三、细胞培养样品制备

1. 贴壁细胞

2. 上清细胞

3.组织制备


分离凝胶浓度(%)

蛋白质大小范围 (kDa)

8

25-200

10

15-100

12.5

10-70

15

12-45

20

4-40

上图中:蛋白质分离范围由分辨凝胶浓度决定。Tricine-SDS-PAGE 可用于分离小于 30 kDa 的蛋白质的电泳系统 。

四、蛋白质定量


蛋白印迹实验步骤中的蛋白定量主要采用Bradford 法和 BCA 法。

1. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶制备:6%-15% 分离凝胶由顶部的浓缩凝胶 (5%) 和凝胶梳(10 或 15 个孔)制成。

溶解凝胶(10ml)

浓缩凝胶(3ml)

 

6%

8%

10%

12%

15%

 

H 2 0

5.3

4.6

4.0

3.3

2.3

2.1

30% 丙烯酰胺混合物*

2.0

2.7

3.3

4.0

5.0

0.5

1.5M Tris(pH 8.8)

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

1.0M Tris (pH 6.8) 0.38

10% SDS

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.03

10% APS

0.1

0.1

0.1

.1

0.1

0.03

TEMED

0.008

0.006

0.004

0.004

0.004

0.003

五、上样和电泳


l 将 2X SDS 蛋白质上样缓冲液与蛋白质样品以 1:1 的比例混合。样品预热到 50-60°C。进行预染。

六、蛋白质转移

将蛋白质转移到 PVDF 或 NC 膜上进行抗体检测。


七、抗体孵育



ECL+ 系统和 X 射线胶片用于 HRP 标记的二抗。


苏州阿尔法生物实验器材有限公司13年专注于生物实验室仪器与试剂耗材的供应,试剂耗材包括BCA检测试剂盒、PVDF膜、半干转系统、缓冲液、SDS凝胶、上样缓冲液、裂解液等上千个品种,更多 蛋白印迹实验步骤相关资讯0512-62956104进行咨询。