蛋白免疫印迹法是蛋白质学中常用的检测方法，Wetern Blot-蛋白印迹实验步骤

主要是通过SDS凝胶分离、转印到膜上并进行信号检测的方法。具体实验方法如下：

一、试剂和缓冲液

• l 1x RIPA 缓冲液：50 mM Tris、 150 mM NaCl 、0.1% SDS、0.5% 脱氧胆酸钠、 1% Triton X-100 或 NP40。
• l 1x PBS 缓冲液：137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、2.7 mM Na 2 HPO 4、2.7 mM KH 2 PO 4、 pH 7.4
• l BCA 蛋白检测试剂盒或 Bradford 蛋白检测试剂盒
• l 1.5 M Tris 缓冲液 (pH 8.8)： 90.68 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 将 pH 调节至 8.8，最后 500 ml
• l 1.0 M Tris 缓冲液 (pH 6.8)：60.58 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 将 pH 调节至 6.8，最后 500 ml
• l 10% APS：使用前制备的 1 ml ddH 2 O中的 100 mg AP 。
• l 10% SDS：10 g SDS 在 100 ml ddH 2 O 中。
• l 1x Tris-甘氨酸缓冲液：Tris配比25 mM；  PH=8.3 的甘氨酸配比230 mM、 SDS配比0.1% 。
• l 3x SDS 蛋白上样缓冲液配制：使用PH=6.8 的 Tris 150 mM 、SDS添加6% 、甘油 添加30% 、 EDTA浓度30 mM 和 溴酚蓝 配比0.2% 。缓冲液应随用随配、分装冷冻备用。1x TTBS ： 25 mM Tris（pH 7.5）：0.15 M NaCl 、 0.05% Tween-20、0.001% 硫柳汞
• l 1x 转移缓冲液：3 g Tris、14.4 g 甘氨酸和 200 ml 甲醇，添加 ddH 2 O 至 1L

二、样品制备

样品也可以在一些商业裂解缓冲液中裂解，例如Thermo Fisher的 Pierce IP 裂解缓冲液 ，而不是 RIPA 缓冲液。

三、细胞培养样品制备

1. 贴壁细胞

• l 去除上清液并用 1X PBS 洗涤以去除残留培养基。
• l 添加预冷的 400 ul-1 ml 1X RIPA 缓冲液/100 mm 培养皿。在冰上孵育 5-10 分钟。
• l 完全刮去细胞并转移到冰上预冷的 1.5 ml 微管中。
• l （可选）彻底均质化或超声处理。
• l 4°C 12,000 rpm 离心 10-15 分钟，收集上清液备用。
• l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。 

2. 上清细胞

• l （可选）取出 100 ul 等分试样进行细胞计数。
• l 将细胞转移到预冷的 1.5 ml 微管或 15 ml 试管中，并在 4°C 下以 2000 rpm 的速度离心 5 分钟。
• l 取出培养基，用 1 ml 预冷的 1x PBS 重悬沉淀，然后转移到 1.5 ml 微管中。
• l 在 4°C 下以 2000 rpm 离心 5 分钟。
• l 用 1 ml 预冷 RIPA 缓冲液/10 7 个细胞重悬细胞沉淀
• l 将细胞悬液在冰上摇晃 30 分钟。或彻底均质化/超声处理。
• l 4°C 12000 rpm 离心 10-15 分钟，收集上清液备用。
• l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。

3.组织制备

• l 组织制备和定量。把它们切成小块。
• l 添加约 500-600 ul 预冷的 1x RIPA 缓冲液/100 mg 组织。
• l 彻底均匀组织。
• l 在 4°C 下以 12000 rpm 离心 15-20 分钟。
• l 收集上清液备用。
• l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。

上图中：蛋白质分离范围由分辨凝胶浓度决定。Tricine-SDS-PAGE 可用于分离小于 30 kDa 的蛋白质的电泳系统 。

四、蛋白质定量

蛋白印迹实验步骤中的蛋白定量主要采用Bradford 法和 BCA 法。

1. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶制备：6%-15% 分离凝胶由顶部的浓缩凝胶 (5%) 和凝胶梳（10 或 15 个孔）制成。

五、上样和电泳

l 将 2X SDS 蛋白质上样缓冲液与蛋白质样品以 1:1 的比例混合。样品预热到 50-60°C。进行预染。

六、蛋白质转移

将蛋白质转移到 PVDF 或 NC 膜上进行抗体检测。

• l 在 1X 转印缓冲液中预润湿凝胶、Whatman 纸和海绵等材料。
• l PVDF 膜应在甲醇中孵育 10 秒。至 1 分钟，然后移至 1X 转移缓冲液。
• l 将以下材料堆叠：外壳（黑色面）、海绵、Whatman 纸、凝胶、膜、Whatman 纸、海绵、外壳（透明面）。
• l 将黑色面朝黑色放入转印设备中。
• l 在低温环境中，使用转印缓冲液进行转印操作。转印电流和时间可以根据实验过程和使用说明进行优化。

七、抗体孵育

• l 一抗在 1X TBST+3% BSA 中以推荐的稀释度稀释或根据结果优化稀释度。
• l 在 4°C 下孵育过夜或更长时间，或在室温下孵育 4 小时。
• l 回收一抗并储存在 4°C。然后在 RT 的振动筛上洗涤膜 3X 5-10 分钟。
• l 在 1X TBST 中稀释二抗并将膜在室温下孵育 1 小时或在振荡器上在 4°C 下孵育 2-4 小时。
• l 在 RT 的摇床上用 TBST 洗涤 3X 10 分钟。

ECL+ 系统和 X 射线胶片用于 HRP 标记的二抗。

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