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常见问答
PCR-PCR技术-PCR实验前需要哪些准备?
来源: 阿尔法生物 时间:2021-12-08

标签:引物设计 定量pcr pcr   ct pcr实验室 

PCR是现代分子生物学实验室的技术。PCR技术主要应用于复制、测序或定量 DNA简而言之,PCR(聚合酶链反应)是一种利用热循环和酶来快速可靠地复制 DNA 的生化技术。


PCR技术

在进行PCR实验前需要做以下准备:

1. 聚合酶

聚合酶是一种酶,在适当的条件下,可以从模板 DNA 和核苷酸组装新的 DNA 链。最初的 PCR 反应很麻烦,因为使 DNA 变性所需的高温会杀死聚合酶。

这意味着在每次加热循环后,必须手动将新的聚合酶添加到反应中。然而,在现代 PCR 中,这不是问题,因为聚合酶通常来自两种嗜热细菌,即:栖热菌或者烈性火球菌。

这些聚合酶分别称为 Taq(发音为“tack”)和 Pfu(发音为“PFU”),可以轻松承受与 PCR 相关的高温。正常情况下,目前市场上的商业 Taq Pfu 聚合酶已具备速度、保真度、持续合成能力(完成长读取的能力)以及读取富含 GC 的模板的能力。可以根据不同的实验要求来来选择不同Taq 酶。

2. 模板 DNA

这是您的聚合酶将读取和复制的 DNA。您的模板 DNA 可以是基因组、质粒或 cDNA,但无论您的来源如何,质量都很重要。模板 DNA 的完整性和纯度越高,就越容易获得良好的 PCR 结果。此外,请记住,理想的 DNA 量取决于您的来源,但通常每次 PCR 1 pg – 1 ng 质粒 DNA 1 ng – 1 µg 基因组 DNA

3. 引物

PCR技术中,引物合成也是重要的一环。引物是与模板 DNA 结合的合成 DNA 的短片段。

实验中通常需要设计两个引物:一个“正向”引物和一个“反向”引物。

您的正向引物指定 PCR 的开始。该引物的序列与您的 5´-3´ 模板 DNA 序列相同。

您的反向引物指定您的 PCR 结束。该引物的序列是模板 DNA 的反向互补序列。

通常,引物长度为 18-22 个碱基对。然而,比它们的长度更重要的是它们的熔化温度。

引物的熔解温度应为 54–60°C,并且彼此尽可能相似。

有很多在线计算器可以计算引物退火温度,大多数合成引物的公司都提供此类计算器。

4. 核苷酸

作为 DNA 的单体,核苷酸是 DNA 复制所必需的。对于大多数 DNA PCR,您将使用脱氧核苷三磷酸 (dNTP)。您可以单独购买这些产品,也可以将它们作为 dGTPdCTPdATP dTTP 混合物购买。

5. 缓冲液:

大多数商业聚合酶都提供了理想的缓冲液。这些缓冲液不仅提供正确的 pH 值,而且始终含有镁、钾或 DMSO 等添加剂,有助于优化 DNA 变性、复性和聚合酶活性。

6. PCR仪:需要根据实验目的来选择相对应的PCR仪。近年来,国产的PCR仪市场火热,很多实验室中也较为常见,比如:朗基的A300T20Q2000C等型号。

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