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常见问答
PCR产物的克隆-DNA回收实验步骤
来源: 阿尔法官网 时间:2022-09-21
PCR产物的克隆-DNA回收实验步骤

【实验原理】

1.DNA片段回收方法:DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中,通上一定电压进行电泳,不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶,用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3’T突出端的载体,在连接酶作用下,可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点,可用于PCR产物的克隆和测序。

  商品化的T载体有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。这个载体以pUC19载体为基础,消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点,经EcoRⅤ酶切后在两侧的3'端添上“T”制备而成(见附录1)。由于本载体上消除了多克隆酶切位点,克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下,需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。

【试剂与器材】

(一)试剂

1.pMDTM18-T Simple Vector Kit(Takara公司)。

2.TAE电泳缓冲液

3.琼脂糖(Agarose)

4.6×电泳加样缓冲液:0.25%溴粉蓝,40%(w/v) 蔗糖水溶液,贮存于4℃。2 / 9

5.溴化乙锭(EB)溶液母液:配制成10mg/mL,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。

6.70%乙醇

7.胶回收试剂盒(Omega公司)

(二)器材

  水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。

【操作方法】

  (一)胶回收试剂盒回收PCR产物(以Omega公司Gel Extraction Kit为例)

1.当目的片段DNA完全分离时,转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。

2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中,称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积(假设其密度为1g/ml)。加入等体积的Binding Buffer(XP2),于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全融化,每2-3 min振荡混合物。(在凝胶完全溶解之后,注意凝胶-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的话,DNA的产量将大大减少。如果是橙色或红色,则要加入5μl 浓度为5 M,pH为5.2的醋酸钠,以调低其pH值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。)

3.取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干凈的2ml收集管内(已备好)。

4.将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟。弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内收集管。

5.如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul,一次只能转移700ul至柱子中,余下的可继续重3 / 9

  复第5步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind DNA回收纯化柱都有一个极限为25μg DNA的吸附能力。如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱子中。

6.弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内收集管。转移300μl Binding Buffer(XP2)至柱子中,室温下,10,000 x g下离心1min。

7.弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内收集管。转移700μl SPW Wash buffer(已用无水乙醇稀释的)至柱子中。室温下10,000xg离心1min。(浓缩的SPW Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的,须将其拿出置于室温下)。

8.重复用700μl SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。

9.弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。

10.把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上,加入15~30μl(具体取决于预期的终产物浓度)的Elution Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上,室温放置1min, 13,000xg离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA。如果再洗脱一次的话,可以把残余的DNA洗脱出来,不过那样的浓度就会较低。

  (二)连接反应(以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit为例)

1)在微量离心管中配制下列DNA溶液,全量为5 μl。

pMDTM18-T Simple Vector1 μlInsert DNA0.1 pmol~0.3 pmoldH2Oup to 5 μl4 / 9

2)加入5 μl(等量)的Solution I。

3)16℃反应30分钟。(2 kbp以上长片段PCR产物进行DNA克隆时,连接反应时间请延长至数小时)。

4)全量(10 μl)加入至100 μl 感受态细胞中,冰中放置30分钟。

5)42℃加热45秒钟后,再在冰中放置1分钟。

6)加入890 μl LB培养基,37℃振荡培养60分钟。

7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养,形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8)挑选白色菌落,鉴定载体中插入片段的长度大小。

【注意事项与提示】

1.使用新鲜的电泳缓冲液TAE Buffer。不要重复使用,其PH的升高会减少产量。

2.不论采取何种方法回收DNA,在回收过程中,要尽量减少洗脱体积,以便提高收得率和浓度,以方便后续操作。

3.从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm),以减少紫外光对DNA的切割。DNA曝露在紫外灯下不能超过30秒。

4.连接反应时间是与温度密切相关,因为反应速度随温度的提高而加快。通常可采用16℃连接4小时为宜,如是平端连接需要适当延长反应时间以提高连接效率;在选择反应的温度与时间关系时,也要考虑在反应系统中其他因素的影响。

5.连接反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染,为防止酶活性降低,取酶时应在冰上操作且动作迅速。7.  

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6.连接反应应在25℃以下进行,温度升高较难形成环状DNA,影响连接效率。长片段PCR产物(2kb以上)进行连接时,连接反应时间应延长至数小时。

7.进行克隆时,Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1:2~10。根据实验情况选择合适的摩尔数比。

8.用高效的感受态细胞(转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19),这样才可能得到比较理想的阳性克隆。

 

9.试剂盒配有Control DNA。通过对照实验判断试剂盒的保存效果。

【实验安排】

  第一天下午:配制6×电泳加样缓冲液、TAE等缓冲液,将各种耗材灭菌。

  第二天上午:制备琼脂糖凝(1%),电泳检测,切胶回收DNA片段

  第二天下午:大肠杆菌制备感受态细胞;DNA与T载体连接转化大肠杆菌。

第三天上午:观察转化结果(蓝白斑情况),计算重组率。

  附录1

 

 

附录2