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常见问答
基因组DNA提取与质粒DNA提取有什么不同?

标签:基因组  dna提取 科学  科普

在分子生物实验中我们通常会提取基因组DNA和质粒DNA,不知道大家有没有注意到,同样是DNA提取 ,但提取方法确实截然不同的。比如:要分离质粒 DNA,就需要打开细胞并进行小量制备,尽量避免污染基因组DNA 。而对于基因组DNA,只需要用不同的方式来打开细胞并尝试分离出尽可能多的内容物就可以了 。

提取DNA

一、基因组DNA提取:

1. 细胞裂解

基因组 DNA (gDNA) 的提取 程序较为简单,是用强裂解液裂解细胞将 gDNA 释放到溶液即可。对于酵母、植物和细菌等具有坚固细胞壁的样本需要 通过酶促反应和机械破壁等方法破坏细胞壁后,再进行DNA提取。细胞壁通常容易被溶菌酶消化,溶菌酶可水解细胞壁肽聚糖和丝氨酸蛋白酶 K。所以对于某些革兰氏阳性菌,溶葡萄球菌素将进一步帮助酶消化。当然对于不同细胞壁成分的生物样本 ,需要使用不同的酶。

机械破壁中,高速珠磨法是通用的 gDNA 提取裂解方法。实验中使用 0.1 毫米玻璃珠或 0.15 毫米细磁珠在涡旋振荡器上就可以 轻松完成此操作。对于坚韧的丝状真菌(例如曲霉属和镰刀菌属),细胞材料可以在液氮中速冻,并在研杵和研钵中研磨,然后在含适当裂解缓冲液的溶液中快速涡旋搅拌即可完成破壁操作 。

2.DNA纯化

细胞裂解(将 gDNA 带入溶液)后,接下来要做的就是纯化样品。普通实验中是一般使用苯酚- 氯仿或旋转过滤膜技术来实现,也可以使用DNA纯化相关试剂盒。

3.基因组DNA提取时的注意事项

染色体在纯化过程中会断裂,这对于 PCR 和 qPCR实验来说,断裂实际上可能是有利的,因为它有助于 DNA 熔解,从而导致更有效的扩增反应。然而,对于长读长测序和 长距离测序)使用,这样的DNA片段将不适用。如果确实需要分离较长 DNA 片段,则应该考虑另外的细胞裂解方式。

DNA提取

二、质粒DNA提取

质粒 DNA 提取有点棘手,因为质粒 DNA 必须与 gDNA 分开。这种分离基于DNA片段的大小,而良好的分离依赖于使用正确的裂解方法。

1. 碱裂解

对于质粒 DNA 提取,细胞裂解需要考虑的因素也较多。Birnboim 和 Doly于 1979 年发明了通用的碱裂解 提取质粒 DNA 的方法。

裂这种裂解法里的裂解缓冲液中含有氢氧化钠和 SDS,可较完全地变性 质粒和 gDNA(即将 DNA 分离成单链)。需要注意的是此步骤必须快速执行,因为过度变性可能会导致质粒不可逆地变性。

接下来,样品在醋酸钾溶液中被中和以复性质粒。这是分离质粒和 gDNA 的关键。由于质粒很小,它们很容易重新退火形成 dsDNA。然而,基因组 DNA 太长而无法完全重新退火,相反它往往会缠结,因此互补链保持分离。

在离心过程中,gDNA(与蛋白质结合)形成沉淀,而质粒 DNA 保持可溶。这一步的关键是不要剧烈涡旋或混合样品,因为 gDNA 很容易断裂,而且断裂的 gDNA 可能小到足以重新退火并与质粒一起进入溶液中。

2. DNA纯化

该步骤可以使用苯酚-氯仿或旋转过滤器对上清液中的质粒 DNA 进行乙醇沉淀或净化。如果您使用旋转过滤技术,中和缓冲液将包含胍盐,因此裂解物可以直接结合硅胶进行进一步洗涤和洗脱。所得 DNA 纯度足以满足大多数下游分子生物学应用的需求。如果需要质粒转染,则可以选择阴离子交换纯化来去除污染内毒素。当然使用硅胶纯化装置也是可以去除内毒素的 。该纯化方法适用于哺乳动物和其他真核质粒以及其他小的染色体外 DNA 种类。但需要注意,哺乳动物细胞和植物核外细胞器中的 质粒拷贝数通常要低得多。

3. 质粒DNA提取的注意事项

质粒 DNA 通常为 3-5 kb,具体取决于插入片段的大小。存在的特定 复制起点将影响每个细胞的质粒拷贝数。典型的高拷贝质粒,如 pUC 或 pBluescript ,每毫升培养物应产生 4-5 µg DNA。要分离高产量的质粒 DNA,请使用对数后期或稳定早期的培养物。还需要注意使用新鲜的单菌落和新鲜的选择抗生素以正确的浓度制备培养物以维持质粒。重要的是过度生长细菌培养物,可能会导致质粒提取物中的 gDNA 污染。

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