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蛋白质印迹技术(Western Blot)的基本流程和步骤
来源: 苏州阿尔法生物 时间:2022-03-31
蛋白质印迹技术(免疫印迹实验)又称为Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。Western Blot主要用于检测或分析蛋白,应用领域集中在基因表达研究、抗体活性检测和疾病诊断等。
01  蛋白质印迹基本流程图
 
蛋白电泳 

02 western blot步骤
样品准备:
  • Tanon 连续梯度预制胶(4-20% 10 孔/15 孔/17 孔);  (4-12% 10 孔/15 孔/17 孔)
  • Tanon Mops/MES 电泳缓冲液(粉剂)
  • Tanon 预染蛋白 Marker
  • Tanon 4×LDS Loading Buffer
  • Tanon 快速蛋白染液
  • 预制胶规格的选择
 
    
在不使用预制胶的情况下,需要自行配置适合蛋白电泳SDS胶,采取自制胶的方法从加入缓冲液到制胶完成这一过程大概需要花费将近1个小时。并且由于配比过程中的认为误差容易产生浓度不均一,稳定性差,已出现外八型、笑脸型等条带。采用天能系列预制胶具有较高的稳定性和均一性,使蛋白电泳条带更清晰锐利,使得条带更加均匀。还有重要的一点就是可以免去制胶的时间,大大提升了实验效率。
 
蛋白转印使用天能VE-586转移电泳槽主要优势在于:它可以在不埋冰的情况完成的蛋白电泳,如果配合快速转膜液,整个电泳过程只需不到30分钟,可同时转印4块胶,操作方法也比较简便。在缩短转印时间的同时,实现了蛋白样品的高效转印。
 
03  蛋白电泳
目前常用的是SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳),蛋白质会根据分子量大小分开,分子量的蛋白会留在胶的下部,分子量大的会在胶的顶部。
蛋白电泳 
04 转膜
转膜主要是将蛋白质从凝胶转移到膜上,常用的是NC膜和PVDF(聚偏氟乙烯),由于膜与蛋白质高度亲和的能力,所以更容易与蛋白结合。为了便于观察电泳效果和转膜效果,可以使用蛋白预染Marker,以方便判断蛋白分子量大小。
蛋白预染的传统方法是膜将置于脱色摇床上,用1×丽春红染液振荡预染5min。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
蛋白转印使用天能VE-586转移电泳槽主要优势在于:它可以在不埋冰的情况完成的蛋白电泳,如果配合快速转膜液,整个电泳过程只需不到30分钟,可同时转印4块胶,操作方法也比较简便。在缩短转印时间的同时,实现了蛋白样品的高效转印。
 
 
05 封闭
转印完成后,为阻止抗体的非特异性结合,需要用脱脂牛奶或者牛血清蛋白(BSA)作为缓冲液来填充封闭空白结合位点。
加入二抗稀释液(一般1:1000甚至1:10000用TBST稀释),放在摇床上,室温下孵育1h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;再用TBS洗一次,10min,即可进行化学发光反应。
注意:二抗孵育之后也要注意充分洗涤,一般30min左右为宜,如果洗膜不够充分,显影时会造成杂色背景。
 
06 ECL化学发光反应:
在工作台上铺一张保鲜膜,将PVDF膜置于保鲜膜上。将ECL的A和B两种试剂在EP管内等体积混合(注意吸完A试剂后吸B试剂前要更换枪头),然后均匀滴在PVDF膜的蛋白面,反应1~2min后,将PVDF膜上多余的ECL发光液吸干,进行固定。
 
07凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照,使用凝胶成像仪进行成像分析。常用的凝胶成像仪有天能系列的T4600,T5200等系列。 

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